早产儿支气管肺发育不良的代谢组学改变

Metabolomic alterations in preterm infants with bronchopulmonary dysplasia

摘要

目的 分析支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD）患儿在校正胎龄（postmenstrual age, PMA）36周的血清代谢组学改变，筛选其潜在生物标志物及相关代谢通路，并分析其与患儿近期呼吸结局的关系。 方法 采用回顾性病例对照研究，纳入2024年1—12月间郑州大学附属儿童医院收治的胎龄28~32周20例BPD患儿，以及20例胎龄、体重、性别匹配的非BPD早产儿，于PMA 36周进行血清非靶向代谢组学分析。 结果 共筛选出13种可区分BPD的潜在生物标志物（曲线下面积>0.75，P<0.05），其中对苯二甲酸、磷脂酰肌醇、富马酸及溶血磷脂酸等8种显著上调（差异倍数≥1.5）；7α-羟基-3-氧代-4-胆甾烯酸酯、磷脂酰胆碱等5种显著下调（差异倍数≤1/1.5）。通路分析显示，甘油磷脂代谢、苯丙氨酸代谢等5条通路与BPD发生相关。甘油磷脂代谢与胆汁酸代谢紊乱可能影响BPD患儿近期不良呼吸结局。 结论 该研究筛选出的13种显著差异代谢物有望成为诊断BPD的标志物；甘油磷脂代谢与BPD的发生和近期呼吸不良结局相关。

Abstract

Objective To analyze the serum metabolomic changes of preterm infants with bronchopulmonary dysplasia (BPD) at postmenstrual age (PMA) 36 weeks, screen potential biomarkers and associated metabolic pathways, and assess their relationship with short-term respiratory outcomes. Methods A retrospective case-control study was conducted. Infants with gestational age 28-32 weeks admitted to the Children's Hospital Affiliated to Zhengzhou University from January to December 2024 were included. Twenty infants with BPD and 20 gestational age-, birth weight-, and sex-matched non-BPD preterm infants were included. Serum collected at PMA 36 weeks was subjected to untargeted metabolomics analysis, and associations with short-term respiratory outcomes were analyzed. Results Thirteen potential biomarkers distinguishing BPD were identified (area under the curve >0.75, P<0.05). Eight biomarkers—including terephthalic acid, phosphatidylinositol, fumarate, and lysophosphatidic acid—were significantly upregulated (FC≥1.5), while five biomarkers, such as 7α-hydroxy-3-oxo-4-cholestenoate ester and phosphatidylcholine, were significantly downregulated (FC≤1/1.5). Pathway analysis indicated five pathways associated with BPD, including glycerophospholipid metabolism and phenylalanine metabolism. Dysregulation of glycerophospholipid and bile acid metabolism may affect adverse short-term respiratory outcomes in infants with BPD. Conclusions The 13 significantly different metabolites may serve as biomarkers for the diagnosis of BPD. Glycerophospholipid metabolism is associated with the occurrence of BPD and with adverse short-term respiratory outcomes.

Graphical abstract

关键词

支气管肺发育不良 / 非靶向代谢组学 / 血清 / 显著差异代谢物 / 早产儿

Key words

Bronchopulmonary dysplasia / Untargeted metabolomics / Serum / Differential metabolite / Preterm infant

支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD）是早产儿常见的严重并发症，以肺泡和肺血管发育异常为主要特征，导致早产儿早期呼吸机依赖，感染风险高及病死率高，并影响其远期呼吸和神经发育结局^［1-3］。目前，其发病机制尚未明确，也缺乏有效的防治手段。因此，寻找早期生物标志物对识别高风险患儿和靶向干预具有重要意义。代谢组学具有高通量、自动化的技术优势，且成本较低^［4］，而非靶向代谢组学可全面检测代谢谱，通过组间差异分析筛选潜在生物标志物，解析相关代谢通路及调控机制^［5-6］，为BPD防治提供新视角。目前BPD的代谢组学研究有限，已报道的研究分别对羊水^［7］、气管抽吸物^［8］及干血斑^［9］等临床样本进行代谢组学分析，提示BPD发生过程中存在代谢组学改变。但研究结果因不同的研究群体、生物样品、疾病状态及不同的代谢组学技术而存在差异^［10］，且目前的研究没有排除其他早产儿严重并发症的影响。本研究选择胎龄<32周早产儿校正胎龄（postmenstrual age, PMA）36周时的血清样本进行非靶向代谢组学分析，对两组早产儿的胎龄、出生体重及性别进行匹配，并排除患有其他可能导致代谢变化的早产儿严重并发症的患儿，旨在探索BPD的代谢标志物，并初步分析可能与BPD发病相关的代谢通路。

1 资料与方法

1.1　研究对象

本研究为病例对照研究，对象为2024年1—12月期间，于郑州大学附属儿童医院新生儿重症监护病房住院的早产儿。纳入标准：胎龄28~32周且入院日龄<28 d。排除标准：（1）存在严重的先天性畸形、染色体异常、遗传代谢病；（2）合并其他可能影响代谢的严重并发症，如新生儿坏死性小肠结肠炎、重度脑室内出血及需干预的早产儿视网膜病变；（3）资料不完整；（4）PMA 36周之前死亡；（5）发生溶血等标本不合格者。本研究已通过郑州大学附属儿童医院伦理委员会批准（2023-H-K46-01），取得患儿父母的知情同意。

1.2　资料收集

通过郑州大学附属儿童医院电子病历系统收集患儿一般资料、围生期和住院信息，包括性别、胎龄、出生体重、出生方式、肺表面活性物质（pulmonary surfactant, PS）应用、机械通气时间及达全肠内喂养日龄等。

1.3　BPD诊断标准及分组

采用2018年美国国立儿童健康与人类发育研究所的BPD诊断标准：对于胎龄<32周的早产儿，生后持续氧依赖超过28 d，在PMA 36周时伴有影像学证实的持续肺实质病变，至少连续3 d需要氧疗和呼吸支持，才能维持氧饱和度在0.90~0.95之间^［11］。根据是否为BPD分为BPD组和非BPD组。采用1∶1比例，按照胎龄、出生体重、性别为BPD组匹配非BPD的早产儿。

1.4　相关定义

小于胎龄儿、喂养不耐受、宫外生长发育迟缓（extrauterine growth restriction, EUGR）、达全肠内喂养日龄、新生儿坏死性小肠结肠炎等定义参考第5版《实用新生儿学》^［12］。

近期呼吸不良结局指至少发生以下情况之一：（1）在PMA≥45周时仍因呼吸原因住院治疗；（2）首次出院时仍需氧疗（鼻导管吸氧或无创通气）或因呼吸原因应用脉搏血氧仪监测氧饱和度^［11］。进一步将BPD组根据近期呼吸结局将分为呼吸不良结局组和正常结局组。

1.5　样本采集及液相色谱串联质谱检测

所有研究对象于PMA 36周±3 d时，采集晨起空腹静脉血2 mL。血液样本于室温静置凝固后，3 000 r/min离心10 min分离血清，分装后于-80℃冰箱冻存备用。检测前，样本经甲醇沉淀蛋白，离心后取上清液进行分析。色谱分离使用UltiMate 3000 UPLC系统（Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany）进行。采用ACQUITY UPLC T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters，Milford，USA）进行反相分离。代谢物洗脱后用Q-Exactive高分辨率串联质谱仪进行检测。

1.6　代谢组学数据处理

使用R软件处理原始数据并进行中位数归一化。鉴定代谢物所用的数据库包括HMDB（https://hmdb.ca）、PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和杭州联川生物技术股份有限公司自建库In-house数据库。采用偏最小二乘判别分析（partial least square-discriminant analysis, PLS-DA）和两样本t检验联合筛选差异代谢物。筛选标准为变量权重值（variable importance for projection, VIP）≥1，差异倍数（fold change, FC）≥1.5或≤1/1.5，且P<0.05。通过受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve, ROC曲线）比较差异代谢物对BPD发病的预测价值。对筛选出的差异代谢物进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，P<0.05的通路定义为显著富集通路。

1.7　统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，组间比较采用两样本t检验；非正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）［M（P₂₅，P₇₅）］表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用卡方检验或连续校正卡方检验。双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　基本资料

共纳入40例早产儿，BPD组和非BPD组各20例。BPD组EUGR比例、短疗程低剂量地塞米松应用比例、喂养不耐受比例、胆汁酸水平高于非BPD组，有创机械通气时间、无创机械通气时间、总氧疗时间、达全肠内喂养日龄大于非BPD组（P<0.05）。见表1。

2.2　PLS-DA结果

PLS-DA模型图显示，两组之间能够明显分离，两组在代谢物构成方面存在显著差异（图1）。对所构建的PLS-DA模型经过200次置换检测，发现该模型区分程度好，预测率高，不存在“过拟合”现象（图2）。

2.3　差异代谢物筛选及ROC曲线分析

通过二级质谱信息共鉴定出829种代谢物，同时满足FC≥1.5或≤1/1.5、P<0.05且VIP≥1的差异代谢物有37种，其中BPD组中上调差异代谢物24种，下调差异代谢物13种。

所有差异代谢物的ROC曲线分析显示，13种差异代谢物的曲线下面积（area under the curve, AUC）均大于0.75，具有BPD相关生物标志物潜能。其中，BPD组中显著上调的有8种（FC≥1.5），分别为对苯二甲酸、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）、富马酸、D-樟脑磺酸、2-［苯甲氨基］丁二酸、溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid, LPA）、2-［（4-甲氧基苯基）羰氨基］乙酸、2-甲基-2-噁唑啉；显著下调有5种（FC≤1/1.5），分别为7α-羟基-3-氧代-4-胆甾烯酸酯、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC）、十二烷二酸、2-哌啶酮、5-羟色胺。见表2。

2.4　两组早产儿差异代谢物的代谢通路分析

基于富集差异代谢物≥2的标准，筛选出P值最小的5条代谢通路，包括甘油磷脂代谢途径、莽草酸途径生物碱的生物合成、α-亚麻酸代谢、苯丙氨酸代谢和酪氨酸代谢途径，最有可能参与BPD的发生和发展。PC、酪氨酸、反式-2-十二碳烯二酸、5-羟色胺、PI、富马酸、LPA、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine, LPE）是影响这些通路的主要差异代谢物。见表3。

2.5　BPD组患儿近期不同呼吸结局的血清代谢组学分析

BPD组患儿近期呼吸不良结局组5例，正常结局组15例，两组在代谢物构成方面存在显著差异。近期呼吸不良结局组显著上调的差异代谢物有8种，显著下调的有19种。对这些差异代谢物进行KEGG通路富集分析，结果显示，甘油磷脂代谢、次级胆汁酸代谢和初级胆汁酸代谢可能影响BPD近期预后。见图3。

3 讨论

本研究对BPD组和非BPD组PMA 36周时的血清样本进行非靶向代谢组学分析发现BPD组对苯二甲酸、PI、富马酸、D-樟脑磺酸、2-［苯甲氨基］丁二酸、LPA、2-［（4-甲氧基苯基）羰氨基］乙酸、2-甲基-2-噁唑啉相对含量显著升高，而PC、7α-羟基-3-氧代-4-胆甾烯酸酯、十二烷二酸、2-哌啶酮、5-羟色胺显著降低。KEGG通路富集进一步分析发现，BPD的发生可能与甘油磷脂代谢途径、莽草酸途径生物碱的生物合成、α-亚麻酸代谢、苯丙氨酸代谢和酪氨酸代谢途径等有关。

BPD组PI水平显著升高，可能与肺组织纤维化的发生和发展有关^［14］。BPD组PC水平显著降低。PC是PS的主要成分，PC的减少一方面可能由于早产儿早期肺部发育不成熟引起PS原发性合成不足，另外可能与BPD进展中炎症或氧化应激等导致的PS继发性减少有关。PS通过降低肺泡表面张力，维持肺泡的稳定性，减少肺泡反复开放和塌陷导致的机械性损伤，从而降低肺组织的炎症反应和纤维化风险。Akella等^［15］的研究证实，PC生物合成的成熟延迟与BPD的发生相关。Cetinkaya等^［16］发现给小鼠BPD模型注射PC前体物质可以改善高氧引起的肺损伤，从而达到预防BPD的效果。本研究中，BPD组LPA显著升高。有研究发现早产儿由于内源性抗氧化酶、抗氧化应激系统发育不成熟，暴露于高氧环境时容易产生大量氧自由基，引起氧化应激损伤，导致炎性巨噬细胞表达活性溶血磷脂酶D增多^［17-18］，催化LPE、溶血磷脂酰胆碱在细胞外的水解，导致LPA的大量生成^［19-20］，本研究结果与之相符。PI、PC、LPA及LPE共同导致了甘油磷脂代谢途径失调，可能为阐明BPD潜在发病机制提供新的靶点。

本研究中，BPD组对苯二甲酸、富马酸水平显著上调。Ishihara等^［21］发现对苯二甲酸对小鼠的呼吸系统有显著影响，小鼠暴露于对苯二甲酸后，气道阻力显著增加，同时伴随肺部炎症和中性粒细胞浸润，影响肺部的正常发育。Zecchini等^［22］在小鼠动物模型中发现富马酸的积累会导致线粒体损伤，致使衍生于线粒体小囊泡中的线粒体DNA释放，从而引发炎症和免疫反应，可能与BPD的发生有关。

本研究中，7α-羟基-3-氧代-4-胆甾烯酸酯在BPD组显著下降，AUC达到0.863，为最有预测价值的生物标志物。该物质作为胆固醇衍生物，是胆汁酸合成过程中的关键中间体，主要通过氧甾醇7α羟化酶催化27-羟基胆固醇生成；其水平下降可能导致肝X受体信号通路下调^［23］。Ma等^［24］研究发现对BPD大鼠使用肝X受体激动剂可恢复受损的肺泡结构并减少肺泡上皮Ⅱ型细胞凋亡。因此，7α-羟基-3-氧代-4-胆甾烯酸酯水平的下调可能导致肺泡结构受损和Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡，可能影响BPD的发生。

另外，本研究发现甘油磷脂代谢、初级胆汁酸代谢和次级胆汁酸代谢途径可能影响BPD患儿的近期预后。You等^［9］对30例BPD早产儿PMA 36周时血浆样本进行靶向组学分析发现，胆汁酸（鹅去氧胆酸、脱氢石胆酸）对2岁内因呼吸道疾病再入院有较强的预测价值，提示胆汁酸代谢可能也影响到远期呼吸预后。

本研究的局限性：（1）仅基于PMA 36周单次血清样本分析，缺乏多时间点动态监测，无法评估BPD代谢组学的时序变化。（2）胎龄限于28~32周，未涵盖<28周超早产儿，后续将补充分析。（3）本次采用的非靶向代谢组学方法，结果只是相对定量，需通过靶向定量以及高氧早产鼠模型验证差异代谢物在BPD中的直接作用。

综上所述，本研究发现13种血清差异代谢物可能成为BPD潜在生物标志物，主要涉及5个代谢通路。其中甘油磷脂代谢不仅影响BPD的发生，还与BPD患儿近期呼吸不良结局有关。

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