MTHFR基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病氨甲蝶呤药物代谢的关联性分析

Association of MTHFR gene polymorphisms with methotrexate metabolism in children with acute lymphoblastic leukemia

摘要

目的 氨甲蝶呤（methotrexate, MTX）血清浓度和MTHFR基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）大剂量MTX延迟代谢及不良反应的关联性。 方法 纳入2021年8月—2023年12月中国医学科学院血液病医院收治的ALL患儿214例，均检测第1次大剂量MTX用药后的血清浓度和MTHFR C677T和A1298C多态性，回顾性分析患儿数据。 结果 214例ALL患儿中，C677T的TT基因型发生延迟代谢的比率高于CT基因型，CC基因型高于CT基因型。携带A1298C的AC基因型发生Ⅰ级及以上中性粒细胞减少的比率高于AA基因型。MTX的较高浓度和发生Ⅱ级及以上的肾损伤、胃肠道反应和高胆红素血症密切关联。疾病分层为中/高危、年龄>14岁、体重指数≥17 kg/m²是延迟代谢的危险因素；相对于MTHFR C677T CC基因型，C677T CT发生延迟代谢的风险降低；TT与CC相比，对延迟代谢的影响没有显著性差异。 结论 MTX浓度可作为MTX相关毒性的客观标志物，而在充分解救治疗与浓度监测下，单一MTHFR多态性可能不足以指导剂量调整，因此应以浓度监测为主、基因为辅的联合治疗策略。

Abstract

Objective To evaluate the associations of serum methotrexate (MTX) concentrations and MTHFR gene polymorphisms with delayed metabolism of high-dose MTX and adverse reactions in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods Children with ALL treated at the Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, between August 2021 and December 2023 were included (n=214). Serum MTX concentrations after the first HD-MTX administration and MTHFR C677T and A1298C polymorphisms were determined. Clinical data were retrospectively analyzed. Results Among 214 children with ALL, the C677T TT genotype had a higher rate of delayed metabolism than the CT genotype, and the CC genotype had a higher rate than the CT genotype. For A1298C, the AC genotype was associated with a higher incidence of grade I or higher neutropenia than the AA genotype. Higher MTX concentrations were closely associated with grade Ⅱ or higher renal injury, gastrointestinal reactions, and hyperbilirubinemia. Intermediate/high-risk disease category, age >14 years, and body mass index ≥17 kg/m² were risk factors for delayed metabolism. Compared with the C677T CC genotype, the CT genotype had a reduced risk of delayed metabolism, whereas no significant difference was observed between TT and CC. Conclusions Serum MTX concentration serves as an objective marker of MTX-related toxicity. Under adequate rescue therapy and concentration monitoring, a single MTHFR polymorphism appears insufficient to guide dose adjustment. A combined strategy is recommended, with concentration monitoring as the primary approach and genetic factors as an adjunct.

关键词

急性淋巴细胞白血病 / 氨甲蝶呤 / 亚甲基四氢叶酸还原酶 / 基因多态性 / 不良反应 / 儿童

Key words

Acute lymphoblastic leukemia / Methotrexate / Methylenetetrahydrofolate reductase / Gene polymorphism / Adverse reaction / Child

氨甲蝶呤（methotrexate, MTX）是儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）治疗的重要药物，可有效降低髓外复发率并提高患儿长期生存率。然而，大剂量氨甲蝶呤（high-dose methotrexate, HD-MTX）在体内的延迟代谢会引发患儿不同程度的毒副作用，表现为口腔溃疡、消化道溃疡、出血、发热、皮肤损害、骨髓抑制、肝脏损害等，严重时危及儿童生命，HD-MTX代谢呈现出显著的个体差异^［1］。而代谢差异可能与MTX代谢酶与转运体的基因多态性有关，有研究考察了影响体内MTX关键通路的各种相关的单核苷酸多态性，但并未有统一结论^［2-6］，已有较多研究显示亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR）活性重度减低^［7］，可能会导致HD-MTX用药风险增加，但MTHFR基因突变导致的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）是否一定会引起MTX代谢延迟目前尚存在争议。因此本研究对ALL患儿基因多态性和MTX浓度与HD-MTX化疗后延迟代谢和不良反应进行关联分析，并对发生延迟代谢的影响因素进行分析，为儿童ALL治疗中HD-MTX剂量优化及毒副作用管理提供依据。

1 资料与方法

1.1　研究对象

选取2021年8月—2023年12月在中国医学科学院血液病医院适合规范治疗的ALL患儿。本研究方案通过中国医学科学院血液病医院伦理委员会批准（批件号：CAMSCRF2023011-EC-1），并且所有患儿监护人签署知情同意书。

纳入标准：（1）年龄1个月到18岁；（2）骨髓形态学及免疫学分型诊断为ALL。排除标准：（1）其他继发性白血病；（2）先天性免疫缺陷病或代谢性疾病；（3）先天性心脏病伴心功能不全；（4）入组前1个月内使用糖皮质激素≥14 d，或ABL激酶抑制剂超过7 d，或前3个月内有任何化疗、放疗史者。

1.2　给药方案

依据中国抗癌协会小儿肿瘤专业委员会（Chinese Children's Cancer Group, CCCG）ALL方案。氨甲蝶呤（低危组3 g/m²，中/高危组5 g/m²），以MTX总量的1/10 0.5 h内静脉滴注；余量23.5 h内均匀滴注；监测用药后18 h、42 h MTX浓度。巯嘌呤（25 mg/m² ，1次/晚）连续服药14 d。亚叶酸钙：MTX开始后42 h起根据MTX浓度调整解救剂量，直至MTX浓度低于0.1 μmol/L时，停止解救。36 h前出现明显毒性反应者，解救应提前到36 h。

WBC计数≥1.8×10⁹ /L，中性粒细胞计数≥0.3×10⁹ /L且血小板计数>75×10⁹/L才能开始新的HD-MTX疗程；但若WBC计数≥1.8×10⁹/L而中性粒细胞计为0.3×10⁹/L~0.5×10⁹/L或血小板计数为75×10⁹/L~100×10⁹/L，HD-MTX可以开始但应暂停使用巯嘌呤；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）>正常值5倍或总胆红素（total bilirubin, TBIL）>34 mmol/L，直接胆红素（direct bilirubin, DBIL）>24 mmol /L或有黏膜炎时HD-MTX治疗须推迟。

1.3　氨甲蝶呤血药浓度测定

采集患儿静脉血2~3 mL置于真空采血管中，离心取上层血浆，采用酶放大免疫分析法测定氨甲蝶呤血药浓度。分别于氨甲蝶呤静脉滴注后第18、42、66 h采集静脉血，以MTX给药后42 h血药浓度≥1 μmol/L作为延迟代谢的标准，每24 h监测1次MTX浓度直至≤0.1 μmol/L。为避免由于剂量调整带来的MTX浓度和不良反应的偏差，故只收集第1个疗程的MTX血药浓度数据。

1.4　基因型的检测

采集患儿静脉血2~3 mL，置于真空采血管中。取200 μL血浆加入1 mL氯化铵溶液中，翻摇混匀，静置，离心，留取白色沉淀；同法离心3次；将核酸纯化剂加入白色沉淀物中，混匀后静置；取1.5 μL于试剂盒测样管中，置于微量荧光检测仪中进行检测。

1.5　不良反应的收集

采用对患儿MTHFR基因型和MTX浓度均不知情的情况下系统性收集HD-MTX第1疗程期间的不良反应数据。通过实验室参数收集骨髓抑制、肝肾毒性的相关数据，通过随访记录患儿黏膜损伤、恶心呕吐、发热、腹泻等不良反应。不良反应分级采用美国国立癌症研究中心常规毒性判定标准（第五版）^［1］。

1.6　统计学分析

采用IBM SPSS Statistics 24.0软件进行数据分析。满足正态分布的数据用均值±标准差（\overline{x}\pm s）表示，采用独立样本t检验。非正态分布计量资料采用中位数（范围）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料采用例数和百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法（期望频数<5时）。MTHFR基因型与代谢延迟及不良反应的关联性采用皮尔逊卡方检验或连续性修正法或Fisher确切概率法，P<0.05表示有显著性差异。多因素分析时先使用二分类logistic回归对各变量分别进行单因素分析，筛选出P<0.1者纳入最终回归模型，再进行多因素logistic回归，关联性采用风险比（odds ratio, OR）表示。

2 结果

2.1　一般资料

本研究共纳入ALL患儿214例，其中男性125例，女性89例；中位年龄7（范围：0.67~17）岁；中位体重指数（body mass index, BMI）为15.5（范围：11.1~39.2）kg/m²；初诊中位WBC计数3.15（范围：0.84~55.58）×10⁹/L；19 d和46 d微小残留病（minimal residual disease, MRD）以及免疫分型的基本情况见表1，将MTHFR C677T和A1298C分别按照野生型和突变型进行分组，对比患儿的基线资料发现除MTHFR C677T的组间46 d微小残留病变值（P=0.013）和A1298C的组间年龄（P=0.032）有差异有统计学意义外，其余基线值差异均无统计学意义。见表1。

2.2　 MTHFR基因多态性分布

在214例ALL患儿中，MTHFR基因C677T位点CC、CT和TT型分别占19.6%、46.7%和33.6%，A1298C位点AA、AC和CC型分别占75.7%、23.4%和0.9%，各基因型均符合Hardy‑Weinberg平衡（P>0.05），提示该样本符合遗传平衡，即具有群体代表性，具体如表2所示。

2.3　两种基因型患儿MTX延迟代谢的比较

214例患儿中共有78例患儿在第1次HD‑MTX静脉滴注后发生延迟代谢，发生率为36.4%，MTHFR C677T和A1298C各基因型患儿之间MTX延迟代谢的发生率见表3。分别对C677T和A1298C的任意两种基因型间发生延迟代谢与否的频次进行四格表卡方检验，结果显示，C677T的TT基因型发生延迟代谢的比率高于CT基因型（P<0.05），CC基因型高于CT基因型（P<0.05），但CC和TT相比、A1298C的AA和AC相比差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.4　两种基因型患儿MTX不良反应的比较

根据是否发生Ⅰ级或Ⅱ级及以上不良反应，分析不同基因型之间差异是否具有统计学意义。结果显示携带A1298C的AC基因型的患儿Ⅰ级及以上中性粒细胞减少的发生率高于AA基因型（P<0.05），其余各基因型在骨髓抑制、肝肾功能损伤的组间不良反应发生率比较，差异均无统计学意义（表4和表5）。

2.5　不同时间点MTX浓度的不良反应比较

表6显示了不同时间点MTX浓度的不良反应比较。结果显示，18 h、42 h或者66 h较高的浓度水平更易发生Ⅱ级及以上的肌酐升高、呕吐和高胆红素血症（P<0.05）的不良反应。与此同时，66 h MTX较高的浓度水平也更易发生Ⅱ级及以上的贫血（P=0.030），42 h MTX较高的浓度水平更易发生Ⅱ级及以上的血小板减少（P=0.002）。

2.6　MTX延迟代谢的多因素分析

对HD‑MTX给药后影响延迟代谢的多个因素采用二分类logistic回归进行单因素初筛，分析结果显示，年龄（P<0.001）、BMI（P<0.001）、疾病分层（P<0.001）、MTHFR C677T（P=0.007）这些自变量对延迟代谢发生组与不发生组分布差异有统计学意义；性别、MTHFR A1298C、巯嘌呤代谢的基因NUDT15（c.415C>T）、TPMT*3C这些自变量在延迟代谢发生组与不发生组分布差异无统计学意义（P>0.05）。

将上述筛选出的变量纳入多因素logistic回归分析，霍斯默-莱梅肖拟合优度检验显示P>0.05，说明模型的拟合优度效果较好，同时多重共线性诊断显示各自变量的方差膨胀因子均小于10，说明不存在共线性问题。结果如表7所示，疾病分层为中/高危（OR=3.620，95%CI：1.768~7.413，P<0.001）、年龄>14岁（OR=4.099，95%CI：1.033~16.269，P=0.045）、BMI≥17 kg/m²（OR=1.937，95%CI：1.007~3.723，P=0.047）是延迟代谢的危险因素，同时相对于MTHFR C677T CC基因型，CT基因型发生延迟代谢的风险降低（OR=0.300，95%CI：0.133~0.676，P=0.004），TT基因型与CC基因型相比，对延迟代谢的影响差异无统计学意义（P=0.256）。

3 讨论

近些年关于药物代谢对血液系统肿瘤HD‑MTX安全性的研究非常广泛，但是结论却各不相同^［2，8］。本研究主要涉及氨甲蝶呤代谢途径中具有重要意义的2个基因，即MTHFR 677 C>T和MTHFR 1298 A>C。MTHFR是细胞内叶酸稳态和代谢的关键酶，MTHFR基因677和1298位点突变可导致MTHFR酶活性下降15%~85%不等^［9］。对多靶点基因的分析发现，MTHFR 677突变的患儿中，48 h血药浓度高于1 μmol/L的患儿比例超过40%，而TT型患儿中，比例达到55%^［10］。上述研究提示突变患儿血药浓度过高风险显著增加；而黄建权等^［11］和马乐等^［12］研究却显示，MTHFR 677位点（CT及TT）型携带者MTX排泄延迟发生率与CC携带者无显著差异。故近年来关于MTHFR多态性与MTX血药浓度及延迟代谢的关联性研究尚无统一结论。

关于MTHFR多态性与MTX相关毒性的研究结果也不尽相同。最早追溯至2012年，国内有Meta分析显示MTHFR C677T与肝脏毒性、骨髓抑制、口腔黏膜炎、胃肠道毒性和皮肤毒性的发生风险显著关联^［13］。Esmaili等^［8］研究发现MTHFR 677TT基因型与骨髓抑制存在关联，而MTHFR 1298 AC基因型与肝毒性降低有关。王婷^［14］的Meta分析显示，在ALL患儿中，MTHFR C677T的突变基因增加了MTX化疗中肝毒性、胃肠道毒性的发生风险，而MTHFR A1298C多态性与之无相关性。2020年，刘爽等^［15］进行的Meta分析显示，MTHFR C677T突变型可能增加HD‑MTX血液毒性的发生风险；而MTHFR A1298C突变型则可能降低其血液毒性发生风险。

但也有研究显示，MTHFR A1298C的次要等位基因携带者则更容易发生中性粒细胞减少症^［16］。白小红等^［3］研究显示，MTHFR A1298C基因多态性与ALL患儿HD‑MTX化疗后的ADR有关。但也有多项研究显示，MTHFR C677T/A1298C基因多态性与患儿的毒性无显著关联^{［1，9，17］}。所以目前而言，关于MTHFR基因多态性与MTX毒性是否存在关联性还不确定，还需要进一步研究确认。

本研究发现，虽然C677T的TT基因型发生延迟代谢的比率高于CT基因型，但CC基因型高于CT基因型，且CC基因型和TT基因型相比无显著性差异，同时除携带A1298C的AC基因型的患儿Ⅰ级及以上中性粒细胞减少的发生率高于AA基因型以外，其余各基因型的不良反应发生率均无差异。究其原因，可能跟样本量少有关，尤其是发生纯合突变的样本量过少。此外，在临床实践中会给予延迟代谢患儿更大的亚叶酸钙解救剂量和频次以保证患儿的用药安全，一定程度上或许会消除基因多态性的作用^［17-19］。既往也有多项研究与我们关于血液学毒性的结论相一致^［3，20］。此外，治疗过程中其他合并药物（如巯嘌呤等）混杂因素可能也有影响^［21］。

本研究发现，MTX的相关毒性与18 h、42 h和66 h时MTX浓度存在显著关联。既往的研究中也有提到长期高MTX浓度水平和肾功能不全有关^［22］，胃肠道反应和高胆红素血症在韩国ALL患儿群体中也有体现^［4］。由此可见，高MTX浓度水平与整体MTX毒性存在一定关联，MTX浓度可以作为MTX相关毒性的客观标志物^［23］。

本研究的不足之处在于样本量少，目前能够检测的MTX代谢基因有限，缺乏对可能影响MTX清除的联合用药的分析与排查，无法全面反映MTX代谢与药物浓度及副作用的关联性，仍需进一步扩大样本量，开展基础的MTX代谢基因多态性研究，进一步探究MTX代谢与疗效、不良反应的关联。

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