栀子苷通过激活SIRT3信号通路抑制铁死亡减轻内皮细胞炎症损伤的研究

Inhibition of ferroptosis by geniposide via activation of the SIRT3 signaling pathway to alleviate inflammatory injury in endothelial cells

摘要

目的 观察栀子苷（geniposide, GE）对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cell, HCAEC）炎症损伤的作用及机制。 方法 将HCAEC随机分为4组：对照组不予处理，模型组给予LPS（20 ng/mL）处理24 h，GE组给予GE（30 μg/mL）预处理12 h后使用LPS（20 ng/mL）处理24 h，沉默信息调节因子3（silent information regulaton 3, SIRT3）抑制剂组给予GE（40 μg/mL）与SIRT3特异性抑制剂3⁃TYP共同预处理12 h后使用LPS（20 ng/mL）处理24 h。采用CCK⁃8法检测细胞活力，试剂盒检测细胞培养基中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）活性及细胞中丙二醛（malondialdehyde, MDA）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）、亚铁离子（Fe²⁺）水平，DCFH⁃DA荧光探针法检测活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平，Western blot法检测SIRT3、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathuone peroxidase 4, GPX4）、溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）、转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1, TfR1）蛋白表达水平，免疫荧光染色检测SIRT3表达。 结果 与对照组相比，模型组细胞活力、GSH含量、SIRT3荧光强度及GPX4、SLC7A11、SIRT3蛋白表达降低（P<0.05），LDH活性、TfR1蛋白表达及MDA、Fe²⁺、ROS含量升高（P<0.05）；与模型组相比，GE组细胞活力、GSH含量、SIRT3荧光强度及GPX4、SLC7A11、SIRT3蛋白表达升高（P<0.05），LDH活性、TfR1蛋白表达及MDA、Fe²⁺、ROS含量降低（P<0.05）；与GE组比较，SIRT3抑制剂组细胞活力、GSH含量、SIRT3荧光强度及GPX4、SLC7A11、SIRT3蛋白表达降低（P<0.05），LDH活性、TfR1蛋白表达及MDA、Fe²⁺、ROS含量升高（P<0.05）。 结论 GE可改善LPS诱导的HCAEC炎症损伤，其机制可能与抑制细胞铁死亡及激活SIRT3信号通路有关。

Abstract

Objective To study the effect and mechanism of geniposide (GE) on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory injury in human coronary artery endothelial cells (HCAECs). Methods HCAECs were randomly assigned to four groups: control (no treatment); model (LPS 20 ng/mL for 24 hours); GE (GE 30 μg/mL pretreatment for 12 hours, followed by LPS 20 ng/mL for 24 hours); and SIRT3 inhibitor (GE 40 μg/mL plus the SIRT3-specific inhibitor 3-TYP pretreatment for 12 hours, followed by LPS 20 ng/mL for 24 hours). Cell viability was assessed by CCK-8 assay. Lactate dehydrogenase (LDH) activity in culture medium and intracellular malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH), and ferrous ion (Fe²⁺) levels were measured using commercial kits. Reactive oxygen species (ROS) were evaluated by DCFH-DA fluorescent probe method. Western blotting detected the protein expression of silent information regulator 3 (SIRT3), glutathione peroxidase 4 (GPX4), solute carrier family 7 member 11 (SLC7A11), and transferrin receptor 1 (TfR1). SIRT3 expression was examined by immunofluorescence staining. Results Compared with the control group, the model group showed decreased cell viability, GSH content, SIRT3 immunofluorescence intensity, and GPX4, SLC7A11, and SIRT3 protein expression (P<0.05), with increased LDH activity, TfR1 protein expression, and MDA, Fe²⁺, and ROS levels (P<0.05). Compared with the model group, the GE group exhibited increased cell viability, GSH content, SIRT3 immunofluorescence intensity, and GPX4, SLC7A11, and SIRT3 protein expression (P<0.05), and decreased LDH activity, TfR1 protein expression, and MDA, Fe²⁺, and ROS levels (P<0.05). Compared with the GE group, the SIRT3 inhibitor group showed reduced cell viability, GSH content, SIRT3 immunofluorescence intensity, and GPX4, SLC7A11, and SIRT3 protein expression (P<0.05), along with elevated LDH activity, TfR1 protein expression, and MDA, Fe²⁺, and ROS levels (P<0.05). Conclusions Geniposide alleviates LPS-induced inflammatory injury in HCAECs, and the mechanism may involve inhibition of ferroptosis and activation of SIRT3 signaling.

Graphical abstract

关键词

栀子苷 / 沉默信息调节因子3 / 铁死亡 / 脂多糖 / 人冠状动脉内皮细胞

Key words

Geniposide / Silent information regulator 3 / Ferroptosis / Lipopolysaccharide / Human coronary artery endothelial cell

川崎病（Kawasaki disease, KD）是一种以全身系统性血管炎^［1］为主要病变的疾病，可诱发冠状动脉病变（coronary artery lesion, CAL）^［2］。CAL是KD最严重的并发症，内皮细胞损伤在KD相关CAL的发生发展中发挥关键调控作用^［3］，血管内皮组织参与维持血液循环稳态，调控促凝与抗凝系统的动态平衡。血管内皮细胞是构成血管壁的重要屏障，当受到炎症因子刺激时，凝血和抗凝血的平衡状态遭到破坏，进而引发血管内壁炎症激活^［4］。铁死亡是一种以铁依赖性脂质过氧化物过度累积为特征的调节性细胞死亡方式，其发生机制主要与细胞内铁的积累、脂质过氧化物异常堆积及活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量生成密切相关^［5］。铁死亡的细胞形态学表现为线粒体体积皱缩、膜密度增高、嵴结构减少或消失；生化特征表现为谷胱甘肽（glutathione, GSH）含量和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathuone peroxidase 4, GPX4）活性降低^［6］，脂质过氧化产物丙二醛（malondialdehyde, MDA）和ROS水平升高。铁死亡与多种疾病有关，如肿瘤、神经退行性疾病、缺血再灌注相关器官损伤，在血管疾病发病机制中亦起重要作用。抑制铁死亡可显著改善多种血管相关疾病的临床预后，有效缓解血管内皮功能障碍及相关病理损伤，减轻细胞炎症反应^［7］。但细胞内皮炎症与铁死亡之间的分子机制仍需进一步探究。

栀子苷（geniposide, GE）是从栀子果实中提取的环烯醚萜苷类化合物^［8］，具有抗心肌缺血再灌注损伤、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗凋亡等作用^［9］。研究显示，GE可用于心脑血管疾病的防治，能够减轻内皮细胞损伤，增强心肌抗氧化能力、清除氧自由基并抑制心肌细胞凋亡^［10］。此外，GE还可通过抑制炎症反应发挥冠状动脉内皮细胞保护作用，减少血管损伤。沉默信息调节因子3（silent information regulator 3, SIRT3）是Sirtuins家族的重要成员，具有强大的去乙酰化酶活性，在调节线粒体功能、能量代谢、氧化应激、细胞凋亡及自噬等过程中发挥关键作用^［11］，同时参与炎症反应的调控。

SIRT3可通过调节核因子E2相关因子、p53蛋白、GPX4等参与细胞炎症进程，在心血管疾病、神经退行性疾病、肿瘤、代谢性疾病及纤维化疾病等多种疾病中发挥重要作用^［12］。激活SIRT3可有效抑制铁过载介导的泡沫细胞死亡，同时降低相关炎症因子的表达水平。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）可诱导内皮细胞发生炎症反应、产生氧化应激，破坏内皮屏障功能^［13］，引发凝血失衡、细胞凋亡等一系列病理生理改变，对内皮细胞的结构和功能造成严重损伤。LPS广泛应用于心肌损伤的体内外模型构建。但GE能否通过激活SIRT3信号通路抑制铁死亡，进而减轻内皮细胞炎症损伤，仍有待进一步研究。本研究采用LPS诱导人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cell, HCAEC）建立炎症损伤模型，旨在探究GE通过调控SIRT3信号通路及铁死亡对LPS所致HCAEC损伤的保护作用，为KD相关CAL的防治提供新的药物靶点和治疗策略。

1 材料与方法

1.1　实验材料

HCAEC购自深圳百恩维生物技术有限公司，LPS购自北京索莱宝科技有限公司，GE购自美国MCE公司，SIRT3购自武汉三鹰生物技术有限公司，3⁃TYP、抗转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1, TfR1）、抗溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）、抗GPX4购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，CCK⁃8试剂盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）检测试剂盒购自上海碧云天公司，ROS荧光法测试盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒、MDA测定试剂盒购自南京建成生物有限公司，亚铁离子（Fe²⁺）含量检测试剂盒购自北京莱宝科技有限公司，山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG购自北京兰杰柯科技有限公司。

1.2　HCAEC细胞培养和实验分组

HCAEC采用含10 mL/L双抗、100 mL/L胎牛血清的培养基，置于37℃、50 mL/L CO₂、950 mL/L O₂的恒温培养箱中培养。每2~3天传代1次，常规观察细胞形态、密度及培养基颜色变化。将HCAEC随机分为4组：对照组不进行任何处理；模型组给予20 ng/mL LPS处理24 h；GE组给予30 μg/mL GE预处理12 h后，使用20 ng/mL LPS处理24 h；沉默信息调节因子3（silent information regulator 3, SIRT3）抑制剂组给予40 μg/mL GE及SIRT3特异性抑制剂3⁃TYP预处理12 h后，使用20 ng/mL LPS处理24 h。

1.3　CCK⁃8法检测各组细胞活力

将HCAEC以1×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板，培养24 h后按实验设计分组处理。处理结束后，每孔加入10 μL CCK⁃8试剂，37℃避光孵育1.5 h，采用酶标仪检测450 nm处的光密度值，并按试剂盒说明书计算细胞活力。实验独立重复3次。

1.4　LDH活性的检测

HCAEC以100 μL/孔接种于96孔板，培养至细胞贴壁后按实验分组处理。收集细胞培养上清，加入150 μL经PBS 10倍稀释的LDH释放试剂，轻轻混匀后孵育1 h，离心5 min，取120 μL上清，采用酶标仪检测490 nm处吸光度。根据标准曲线计算LDH活性水平，结果以U/L表示。实验独立重复3次。

1.5　DCFH⁃DA荧光探针法检测ROS水平

将HCAEC接种于培养皿/96孔板，按实验分组处理后，加入含10 μmol/L DCFH⁃DA的无血清培养基1.5 mL，避光孵育30 min，每5 min混匀1次；采用无血清培养基洗涤细胞2次。封片后使用荧光显微镜观察并采集图像，检测细胞内ROS水平，以相对荧光强度表示，荧光强度与细胞内ROS水平呈正相关。实验独立重复3次。

1.6　细胞内Fe²⁺、MDA及GSH含量检测

按实验分组处理HCAEC，细胞裂解后收集上清，使用Fe²⁺、MDA、GSH检测试剂盒分别测定细胞内Fe²⁺、MDA和GSH含量，实验步骤严格按照试剂盒说明书操作。

1.7　免疫荧光染色

将无菌盖玻片置于6孔板中，接种HCAEC，PBS漂洗3次，每次5 min；细胞爬片甩干后，在细胞均匀区域画圈标记，加入50~100 μL破膜液，室温孵育20 min，PBS洗涤3次。滴加正常山羊血清封闭液覆盖细胞，室温封闭30 min；加入稀释后的SIRT3一抗（1∶200），4℃湿盒过夜孵育。再加FITC标记二抗（1∶200），室温避光孵育50 min，PBS漂洗3次。DAPI染液避光复染细胞核5 min，TBST漂洗4次，甩干后用抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下采集图像。实验独立重复3次。

1.8　Western blot检测

按实验分组处理HCAEC后收集细胞，加入RIPA细胞裂解液冰上裂解20 min，离心取上清，采用BCA法测定蛋白浓度。取蛋白样品进行SDS⁃PAGE电泳，先以80 V恒压电泳，待蛋白marker充分分离后调电压至120 V，电泳至溴酚蓝至胶底，将蛋白转移至PVDF膜。50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，漂洗后加入GAPDH、GPX4、SLC7A11、TfR1及SIRT3一抗（稀释比例均为1∶1 000），4℃孵育过夜；漂洗后加入对应二抗（稀释比例均为1∶10 000），室温孵育1.5 h，化学发光法显影。以GAPDH为内参，采用Image J软件分析目的蛋白与GAPDH的灰度值比值，即为目的蛋白相对表达水平。实验独立重复3次。

1.9　统计学分析

使用GraphPad Prism 10软件分析数据。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD⁃t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1　GE对LPS诱导的HCAEC细胞活力的影响

CCK⁃8细胞活力检测结果显示，与对照组相比，模型组细胞活力降低（P<0.05）；与模型组相比，GE组细胞活力升高（P<0.05）；与GE组相比，SIRT3抑制剂组细胞活力降低（P<0.05），见表1。

2.2　GE对LPS诱导的HCAEC LDH活性的影响

与对照组相比，模型组LDH活性增加（P<0.05）；与模型组相比，GE组LDH活性降低（P<0.05）；与GE组相比，SIRT3抑制剂组LDH活性增加（P<0.05）。见表1。

2.3　GE对LPS诱导的HCAEC中Fe²⁺、MDA、GSH和ROS水平的影响

与对照组相比，模型组Fe²⁺、MDA、ROS水平增加，GSH水平降低（P<0.05）；与模型组相比，GE组Fe²⁺、MDA、ROS水平降低，GSH水平增加（P<0.05）；与GE组相比，SIRT3抑制剂组Fe²⁺、MDA、ROS水平增加，GSH水平降低（P<0.05）。见表2、图1。

2.4　GE对LPS诱导的HCAEC中GPX4、SLC7A11及TfR1蛋白表达水平的影响

Western blot结果显示，与对照组相比，模型组GPX4、SLC7A11蛋白表达降低，TfR1蛋白表达升高（P<0.05）；与模型组相比，GE组GPX4、SLC7A11蛋白表达升高，TfR1蛋白表达降低（P<0.05）；与GE组比较，SIRT3抑制剂组GPX4、SLC7A11蛋白表达降低，TfR1蛋白表达升高（P<0.05）。见表3、图2。

2.5　GE对LPS诱导的HCAEC中SIRT3表达的影响

Western blot和免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，模型组SIRT3蛋白表达和荧光强度降低（P<0.05）；与对照组相比，模型组SIRT3荧光强度降低；与模型组相比，GE组SIRT3蛋白表达和荧光强度升高（P<0.05）；与GE组比较，SIRT3抑制剂组SIRT3蛋白表达和荧光强度降低（P<0.05）。见表4、图3。

3 讨论

KD是一种儿童急性发热性血管炎，主要影响冠状动脉，冠状动脉损伤可导致血管扩张或血栓形成，对患者构成重大威胁。内皮细胞位于冠状动脉内壁，介于循环系统中炎症细胞与血管中层或外层之间^［14］，其对保持血管结构完整性和维持正常生理功能至关重要^［15］。内皮细胞异常激活或损伤可诱导大量促炎细胞因子释放^［16］，使血液呈高凝状态，导致冠状动脉损伤，表现为血管内皮细胞脱落、大量炎症细胞浸润等^［17］，引发内皮功能障碍。铁死亡是血管内皮细胞死亡的重要形式^［18］，其发生依赖细胞内游离铁（尤其是Fe²⁺）的积累。Fe²⁺能促进Fenton反应，与过氧化氢作用生成ROS^［19］，加速脂质过氧化进程。这些氧化脂质已被证实参与内皮功能障碍与炎症反应。在铁死亡过程中，铁离子依赖性脂质过氧化反应显著增强，导致MDA等脂质过氧化产物大量积累。因此，MDA水平升高不仅可作为铁死亡发生的间接证据，也是评估氧化应激水平的重要指标。GPX4是清除脂质过氧化物的关键酶^［20］，其活性依赖于GSH。当GSH耗竭时，GPX4活性降低，可导致脂质ROS积累，从而诱导铁死亡。SLC7A11^［21］是胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白系统XC^⁃的重要组成部分，抑制SLC7A11可减少GSH生成，导致GPX4失活。Yang等^［20］研究表明，GPX4以GSH为辅因子保护细胞膜免受氧化损伤，抑制铁死亡发生。TfR1是关键的铁代谢相关蛋白^［22］，参与调控铁的摄取、储存与释放。铁过载或铁蛋白降解均可升高细胞内游离铁水平，进而增强细胞对铁死亡的敏感性。本实验结果显示，与模型组相比，GE干预可降低细胞内Fe²⁺、ROS及MDA水平，升高GSH含量；同时上调铁死亡抑制蛋白GPX4和SLC7A11蛋白表达，下调TfR1蛋白表达。上述结果提示，GE可通过抑制铁死亡减轻LPS诱导的HCAEC炎症损伤。

SIRT3是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性去乙酰化酶，可参与调控能量代谢、抗氧化应激及细胞应激反应等过程。铁死亡是当前心血管领域的研究热点，在心肌病、心肌梗死、缺血/再灌注损伤及心力衰竭中发挥重要作用^［23］。SIRT3可调节线粒体代谢和抗氧化系统，减少脂质过氧化物生成，进而抑制铁死亡发生。Cao等^［24研究发现，选择性敲除SIRT3可导致内皮细胞大量凋亡，并加剧血管炎症反应。Jeong等^［25］研究发现，SIRT3活性丧失可引发线粒体ROS大量积累，进而增强铁调节蛋白1对铁反应元件的结合，并影响铁代谢相关基因的表达。SIRT3可通过去乙酰化作用有效激活GPX4及其他线粒体抗氧化酶，清除过量ROS，维持细胞氧化还原平衡，发挥保护心肌细胞的作用。

GE具有抗氧化作用，可抑制氧化应激损伤模型中脂质过氧化物的产生，降低细胞内ROS水平，减轻心肌细胞氧化损伤^［26］。研究显示，GE可通过多途径、多靶点发挥对心血管的保护作用^［27］。本实验结果表明，GE可通过激活SIRT3信号通路显著减轻LPS诱导的HCAEC炎症损伤和铁死亡进程；而经SIRT3特异性抑制剂3⁃TYP处理后，GE介导的细胞保护作用及铁死亡抑制效应均被逆转，证实GE可通过上调SIRT3信号通路，改善LPS诱导的HCAEC炎症损伤并抑制细胞铁死亡。

综上所述，本研究证实GE可通过激活SIRT3信号通路抑制铁死亡，从而减轻LPS诱导的HCAEC炎症损伤。然而，其具体的分子机制仍需进一步阐明。此外，本实验仅局限于细胞水平，鉴于KD发病机制的复杂性，GE在动物模型中是否同样通过抑制铁死亡发挥KD的冠状动脉保护作用，仍有待进一步验证。本研究结果为深入揭示GE的心血管保护机制提供了新的思路。

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