间充质干细胞来源外泌体减轻少突胶质细胞损伤的机制研究

Mechanism of mesenchymal stem cell-derived exosomes in alleviating hypoxia/re-oxygenation-induced injury of oligodendrocytes

摘要

目的 研究间充质干细胞来源外泌体（mesenchymal stem cell‑derived exosome, MSC‑Exo）是否通过调控JAK2/STAT3信号通路调节铁死亡以减轻缺氧复氧（hypoxia/re‑oxygenation, H/R）诱导的少突胶质细胞损伤。 方法 将少突胶质细胞随机分为对照组、H/R组和MSC‑Exo组，除对照组外，其余细胞均进行H/R处理。应用Western blot法检测少突胶质细胞标志物（MAG、Olig2、MOG、MBP）、外泌体标志物（TSG101、CD81、CD63）、内质网蛋白（calnexin）、铁死亡相关蛋白（GPX4、TFR）和JAK2/STAT3信号通路相关蛋白（JAK2、p‑JAK2、STAT3、p‑STAT3）的蛋白表达水平；采用CCK‑8法检测细胞活力；应用分光光度法检测胱天蛋白酶‑3活性、谷胱甘肽（glutathione, GSH）、Fe²⁺含量和丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平；运用流式细胞术检测细胞凋亡水平和活性氧（reactive oxygen species, ROS）活性。为验证MSC‑Exo是否通过JAK2/STAT3信号通路抑制铁死亡，应用JAK2抑制剂（JAK2 inhibitor, JAK2i）后，将少突胶质细胞随机分为H/R组、MSC‑Exo组、JAK2i组和JAK2i+MSC‑Exo组。应用上述检测方法分别检测GPX4、TFR、p‑JAK2和p‑STAT3的蛋白表达水平，以及细胞活力、GSH、Fe²⁺含量、MDA水平、细胞凋亡水平和ROS活性情况。 结果 与对照组相比，H/R组细胞活力和GSH含量降低，ROS活性、MDA含量、Fe²⁺含量和细胞凋亡升高，H/R组TFR、p‑JAK2和p‑STAT3蛋白表达水平升高，GPX4蛋白水平降低（P<0.05）；与H/R组相比，JAK2i组和MSC‑Exo组均可抑制p‑JAK2、p‑STAT3和TFR蛋白表达水平，上调GPX4蛋白水平，提高细胞活力和GSH含量，降低MDA、Fe²⁺含量，抑制ROS活性和细胞凋亡的发生（P<0.05）。 结论 MSC‑Exo可通过抑制JAK2/STAT3信号通路抑制铁死亡的发生，减轻H/R诱导的少突胶质细胞损伤。

Abstract

Objective To investigate whether mesenchymal stem cell-derived exosomes (MSC‑Exo) regulate ferroptosis by modulating the JAK2/STAT3 signaling pathway to alleviate hypoxia/re-oxygenation (H/R)-induced oligodendrocyte injury. Methods Oligodendrocytes were randomly divided into control, H/R, and MSC‑Exo groups. Except for the control group, cells underwent H/R treatment. Western blot analysis was used to detect protein expression of oligodendrocyte markers (MAG, Olig2, MOG, MBP), exosome markers (TSG101, CD81, CD63), endoplasmic reticulum protein (calnexin), ferroptosis-related proteins (GPX4, TFR), and JAK2/STAT3 signaling pathway components (JAK2, p-JAK2, STAT3, p-STAT3). Cell viability was assessed by CCK-8 assay. Spectrophotometric methods were employed to measure caspase-3 activity, glutathione (GSH) content, Fe²⁺ levels, and malondialdehyde (MDA) concentrations. Apoptosis and reactive oxygen species (ROS) production were analyzed by flow cytometry using Annexin-V/PI double staining. To verify the role of JAK2/STAT3 pathway in MSC‑Exo-mediated inhibition of ferroptosis, a JAK2 inhibitor (JAK2i) was applied, and cells were assigned to H/R, MSC‑Exo, JAK2i, and JAK2i + MSC‑Exo groups. The protein expression levels of GPX4, TFR, p-JAK2, and p-STAT3, as well as cell viability, GSH, Fe²⁺, MDA, apoptosis, and ROS production, were determined using the aforementioned methods. Results Compared with the control group, the H/R group showed significantly decreased cell viability and GSH content, and increased ROS, MDA, Fe²⁺, and apoptosis (P<0.05). Protein levels of TFR, p-JAK2, and p-STAT3 were significantly upregulated, while GPX4 was downregulated (P<0.05). Compared with the H/R group, both JAK2i and MSC‑Exo treatments significantly inhibited p-JAK2, p-STAT3, and TFR expression, upregulated GPX4 expression, increased cell viability and GSH content, and reduced ROS, MDA, Fe²⁺, and apoptosis levels (P<0.05). Conclusions MSC‑Exo inhibit ferroptosis by suppressing the JAK2/STAT3 signaling pathway, thereby alleviating H/R-induced oligodendrocyte injury.

Graphical abstract

关键词

间充质干细胞来源外泌体 / 铁死亡 / JAK2/STAT3 / 少突胶质细胞

Key words

Mesenchymal stem cell-derived exosome / Ferroptosis / JAK2/STAT3 / Oligodendrocyte

全球每年约有1 500万早产儿出生^［1］，其中7%会出现认知障碍、视听缺陷及脑性瘫痪等不良神经结局，每年受累早产儿约91万^［2］。早产儿神经细胞与脑血管发育尚未成熟，在缺血缺氧、宫内炎症等多种损伤因素作用下极易发生脑损伤，其病理核心改变为脑白质损伤（white matter injury, WMI），主要表现为少突胶质细胞成熟障碍、小胶质细胞浸润及髓鞘结构损伤等。少突胶质细胞是中枢神经系统中数量最丰富的神经胶质细胞^［3］，也是早产儿WMI中最主要、最关键的受损靶细胞^［4］。目前，临床针对早产儿WMI仍以对症支持治疗为主，尚缺乏能够有效促进脑白质修复与髓鞘再生的特异性干预策略，亟需探索新的治疗靶点与干预途径。

间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）具有自我更新与多向分化潜能，已被广泛应用于脑血管疾病、神经退行性疾病、脊髓损伤等多种神经系统疾病的临床前研究与临床试验^［5‑6］。研究证实，在新生儿缺氧缺血性脑病动物模型中，MSC干预可有效促进神经功能恢复并改善脑损伤^［7］。此外，也有证据表明，MSC主要通过旁分泌途径释放微泡、外泌体（exosome, Exo）等细胞外囊泡发挥神经保护作用，其中Exo是介导其生物学效应的核心活性物质^［8］，近年来已成为神经修复领域的研究热点。多项研究显示，MSC‑Exo可通过抑制细胞凋亡与炎症反应，减轻创伤性脑损伤等中枢神经系统损伤^［9］，与MSC直接移植相比，MSC‑Exo具有无致瘤性、无致畸风险等显著优势，具备更高的临床转化安全性^［10］。尽管MSC‑Exo改善神经功能障碍的重要作用已被多项研究证实^{［11‑12］}，但其在早产儿WMI修复中的具体作用及潜在分子机制仍未完全阐明。

Janus激酶2/信号转导及转录激活因子3（janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3, JAK2/STAT3）通路的异常激活亦被证实参与胶质瘤细胞存活、增殖与侵袭等过程^［13］。此外，MSC‑Exo可通过调控STAT3促进脊髓损伤修复^［14］。铁死亡作为一种铁离子依赖性的程序性细胞死亡方式，已被证实在脑卒中、创伤性脑损伤及神经退行性疾病等多种神经系统损伤中扮演关键角色^{［15‑17］}，亦有研究显示钙结合蛋白S100A8可通过JAK2/STAT3通路介导血管性痴呆中的铁死亡^［18］，进一步提示JAK2/STAT3在铁死亡调控中的关键作用，但其在MSC‑Exo神经保护中的作用尚不明确。为此，本研究拟探讨MSC‑Exo是否通过调控JAK2/STAT3信号通路抑制少突胶质细胞铁死亡发挥保护作用，以期为临床防治早产儿WMI提供实验基础与理论依据。

1 材料与方法

1.1　主要材料和仪器

少突胶质细胞（MO3.13）、MSC（iCell‑e009‑002h）购自上海赛百慷生物技术股份有限公司。DMEM培养基（C11995500BT）、胰蛋白酶及双抗溶液购自美国Gibco公司。CCK‑8（C0037）、RIPA裂解液（P0038）、胱天蛋白酶‑3（cysteine‑aspartic acid protease 3, caspase‑3; C1077S）、Fe²⁺（C1190S）及丙二醛（malondialdehyde, MDA; s0131s）检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。β‑Tubulin抗体购自武汉赛维尔生物科技有限公司。谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）、转铁蛋白受体（transferrin receptor, TFR）、TSG101、内质网蛋白calnexin、CD81、JAK2、p‑JAK2、STAT3、p‑STAT3、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG）、髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）、少突胶质细胞转录因子2（oligodendrocyte transcription factor 2, Olig2）购自武汉三鹰生物技术有限公司。髓鞘相关糖蛋白（myelin‑associated glycoprotein, MAG）购自浙江欧赛思生物科技有限公司。JAK2抑制剂（JAK2 inhibitor, JAK2i; NSC42834）购自美国MedChemExpress公司。主要仪器包括Western blot发光仪（美国Bio‑Rad公司）、流式细胞仪（美国BD Biosciences公司）、高速离心机（德国Beckman公司）、低温离心机（德国Eppendorf 公司）、CO₂细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2　MSC提取和培养

MSC采用α‑MEM培养基培养，置于含37 ℃、5% CO₂、95%空气的培养箱中培养，每2 d换液1次，显微镜下观察细胞形态和生长情况，按照细胞生长情况进行传代，采用第3代MSC进行实验。

1.3　MSC‑Exo获取与鉴定

第3代MSC接种于10 cm培养皿中，待细胞贴壁后，更换为无血清培养基继续培养48 h。收集细胞培养上清液，首先在4℃条件下，离心3次（4 240 r/min离心30 min、9 460 r/min离心50 min、29 900 r/min超速离心90 min）以去除细胞碎片及凋亡小体，用预冷的20 mL PBS轻柔重悬沉淀，4℃、29 900 r/min离心90 min进行洗涤。最后，弃去上清液，用预冷的200 μL PBS重悬沉淀，所得样品即可用于后续实验。采用透射电子显微镜观察MSC‑Exo的超微结构，采用纳米颗粒跟踪分析测定MSC‑Exo的粒径和浓度。

1.4　模型制备与分组

1.4.1　H/R损伤模型的建立

为建立H/R诱导的少突胶质细胞损伤模型，H/R组细胞先于缺氧条件下（37℃、99% N₂、1% O₂）培养12 h，再于正常条件下（37℃、5% CO₂、95%空气）复氧培养12 h^［19］。所有实验均独立重复3次（3批独立细胞样本，每批每组设3个复孔）。

1.4.2　分组

为探讨MSC‑Exo对少突胶质细胞H/R损伤的保护作用，首先将细胞分为对照组、H/R组、MSC‑Exo组。对照组细胞于正常条件下（37℃、5% CO₂、95%空气）培养；MSC‑Exo组少突胶质细胞在H/R处理前，使用MSC‑Exo预处理48 h，然后进行上述H/R处理。为验证MSC‑Exo是否通过JAK2/STAT3信号通路抑制铁死亡起保护作用，增设JAK2i组，使用JAK2i预处理12 h，然后进行上述H/R处理，共分为4组：H/R组（模型对照组）、MSC‑Exo组、JAK2i组、JAK2i+MSC‑Exo组。在JAK2i+MSC‑Exo组中，先加入MSC‑Exo干预36 h，随后加入JAK2i继续孵育12 h，之后再进行H/R处理。

1.5　CCK‑8法检测细胞活力

调整少突胶质细胞密度至5×10⁴个/mL，以每孔100 μL（即5×10³个细胞/孔）接种于96孔板中，每组设3个复孔。细胞贴壁培养24 h后，每孔加入CCK‑8溶液10 μL，37℃避光孵育30 min。以不含细胞的培养液孔为空白对照，使用酶标仪测定450 nm处吸光值。

1.6　流式细胞术检测细胞凋亡水平

将少突胶质细胞用胰蛋白酶消化，显微镜下观察到50%～60%的细胞变圆后，加入3倍体积的DMEM以终止消化，离心收集细胞沉淀，用200 μL 1×结合缓冲液洗涤3次后，先后加入5 μL Annexin V‑FITC和5 μL PI染液，混匀，室温避光孵育15 min，再通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.7　Caspase‑3活性的检测

收集不同处理的少突胶质细胞，加入裂解液冰上裂解15 min，4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度后，取等量蛋白50 μg加入含caspase‑3底物（DEVD‑pNA）的反应液，37℃孵育2 h，酶标仪测定405 nm处吸光值。

1.8　检测MDA含量

取各组细胞，用预冷PBS洗涤2次，加入RIPA裂解液（含PMSF）冰上裂解15 min，4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清。按照MDA检测试剂盒说明书操作，加入反应试剂，混匀后沸水浴加热15 min，冷却后离心，取上清液用酶标仪测定532 nm处吸光值。

1.9　采用流式细胞仪检测活性氧活性

取各组细胞，使用0.25%的胰蛋白酶进行消化，弃去上清加入200 μL PBS洗涤3次，取沉淀用1 mL PBS重悬，加入荧光探针DCFH‑DA，用流式细胞仪测定相对荧光强度，反映活性氧（reactive oxygen species, ROS）活性。

1.10　检测GSH含量

取各组细胞，弃去培养基后用预冷的PBS洗涤细胞3次，加入RIPA裂解液冰上裂解细胞，冰浴超声破碎细胞，4℃、10 400 r/min离心10 min。依次将样品、标准品以每孔100 μL加入96孔板，检测412 nm处各孔吸光值，并计算样本中谷胱甘肽（glutathione, GSH）含量。

1.11　检测Fe²⁺含量

取各组细胞，弃去培养基，PBS洗涤1次，加入胰蛋白酶消化细胞，收集沉淀。加入缓冲液，混匀，冰上裂解10 min。用玻璃匀浆仪在4℃进行匀浆，10 400 r/min离心3~5 min，收集上清液。另设空白孔（显色液）、标准曲线孔（不同浓度铁标准液+显色液）及样品孔（上清液+显色液）。用酶标仪在593 nm处测定每组样品的吸光值。按标准曲线计算Fe²⁺含量。

1.12　Western Blot

取各组细胞，RIPA裂解提取总蛋白，BCA法测定并标化浓度。取等量蛋白进行12.5% SDS‑PAGE电泳、转膜，5%脱脂奶粉TBST封闭1 h后，分别加入以下一抗于4℃孵育过夜：兔抗MAG（1∶1 000）、兔抗MOG（1∶1 000）、兔抗Olig2（1∶500）、兔抗MBP（1∶1 000）、兔抗GPX4（1∶1 000）、兔抗TFR（1∶1 000）、兔抗JAK2（1∶1 000）、兔抗p‑JAK2（1∶1 000）、兔抗STAT3（1∶1 000）、兔抗p‑STAT3（1∶1 000）及小鼠抗GAPDH（1∶5 000），次日TBST洗膜后，HRP标记二抗（1∶5 000）37°C孵育1 h，增强化学发光检测，Image J分析条带灰度值。

1.13　统计学分析

使用SPSS 22.0、GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。符合正态分布的数据以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性组间两两比较采用LSD‑t检验，方差不齐时采用Dunnett‑t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　少突胶质细胞的鉴定与MSC‑Exo的表征检测

Western blot结果显示，在H/R模型中，少突胶质细胞标志蛋白MAG、MOG、Olig2和MBP的表达水平均下降（图1A）；MSC‑Exo表达典型标志蛋白TSG101、CD81及CD63，而未检测到calnexin（图1B）。通过透射电子显微镜观察MSC‑Exo有典型“杯盘”形态（图1C）；纳米颗粒跟踪分析显示MSC‑Exo粒径分布集中在30~150 nm之间，平均粒径为142.4 nm，浓度为6.3×10¹⁰粒子/mL。以上证实本研究所用的MSC‑Exo纯度高、形态和粒径均符合Exo表征。

2.2　MSC‑Exo对H/R诱导少突胶质细胞损伤的影响

与对照组相比，H/R组细胞活力降低（P<0.05），caspase‑3活性上升（P<0.05）；与H/R组相比，MSC‑Exo组细胞活力升高（P<0.05），caspase‑3活性下降（P<0.05）。流式细胞术结果显示，H/R组细胞凋亡增加（P<0.05），MSC‑Exo组细胞凋亡减轻（P<0.05），见表1、图2。

2.3　MSC‑Exo对H/R诱导少突胶质细胞氧化应激的影响

与对照组相比，H/R组GSH含量下降（P<0.05），MDA含量、Fe²⁺含量及ROS活性上升（P<0.05）；与H/R组相比，MSC‑Exo组GSH含量上升（P<0.05），MDA含量、Fe²⁺含量及ROS活性下降（P<0.05），见表2。

2.4　MSC‑Exo对H/R诱导少突胶质细胞铁死亡的影响

与对照组相比，H/R组GPX4蛋白表达下调（P<0.05），TFR蛋白表达上调（P<0.05）；与H/R组相比，MSC‑Exo组GPX4蛋白表达上调（P<0.05），TFR蛋白表达下调（P<0.05）。见表3、图3。

2.5　MSC‑Exo对JAK2、STAT3、p‑JAK2及p‑STAT3蛋白的影响

与对照组相比，H/R组JAK2、STAT3、p‑JAK2及p‑STAT3蛋白表达增加（P<0.05）。与H/R组相比，MSC‑Exo组JAK2、STAT3、p‑JAK2及p‑STAT3表达均较H/R组降低（P<0.05）。见图4、表4。

2.6　JAK2i对p‑JAK2、p‑STAT3蛋白表达的影响

与对照组相比，H/R组p‑JAK2与p‑STAT3磷酸化水平增加（P<0.05）；与H/R组相比，JAK2i组p‑JAK2与p‑STAT3磷酸化水平下降（P<0.05）。细胞活力检测结果进一步表明，H/R组细胞活力显著下降（P<0.05），而JAK2i干预则能够显著恢复细胞活力（P<0.05）。见表5、图5。

2.7　JAK2i及MSC‑Exo对细胞凋亡和氧化应激的影响

流式细胞术结果显示，与H/R组相比，JAK2i组、MSC‑Exo组细胞凋亡、ROS活性降低（P<0.05）。与JAK2i组、MSC‑Exo组相比，JAK2i+MSC‑Exo组细胞凋亡减轻、ROS活性降低（P<0.05）。与H/R组相比，JAK2i组与MSC‑Exo组细胞活力升高，GSH含量升高，MDA、Fe²⁺含量降低（P<0.05）；JAK2i+MSC‑Exo组上述改变更加显著（P<0.05）。见表6、图6~7。

2.8　JAK2i和MSC‑Exo对铁死亡的影响

与H/R组相比，JAK2i组、MSC‑Exo组、JAK2i+MSC‑Exo组GPX4蛋白表达升高（P<0.05），TFR蛋白表达下降（P<0.05）；与JAK2i组、MSC‑Exo组相比，JAK2i+MSC‑Exo组GPX4蛋白表达进一步升高（P<0.05），TFR蛋白表达进一步降低（P<0.05）。见表7、图8。

3 讨论

WMI是早产儿最常见的严重脑损伤类型，也是导致脑性瘫痪等终身神经功能障碍的核心病因，其病理本质为白质发育过程中少突胶质细胞成熟延迟或受阻引发的髓鞘形成障碍^［21］。因此，调控少突胶质细胞存活、增殖与分化，减轻其损伤，是干预早产儿WMI、促进功能恢复的重要靶点^［22］。目前临床针对早产儿WMI 仍缺乏有效治疗手段，探索其潜在干预靶点具有重要的临床意义。MSC‑Exo作为干细胞旁分泌效应的核心载体，研究表明其具有神经保护、抗凋亡等多重生物学活性^［23］。本研究聚焦少突胶质细胞的H/R损伤模型以模拟WMI中少突胶质细胞损伤的病理过程，旨在为早产儿WMI的治疗提供实验依据。

既往研究表明，H/R会导致自由基大量产生，当超出细胞的清除能力时便会引发氧化应激，进而破坏蛋白质、脂质及DNA，使细胞正常功能受损，表现为细胞活力下降，氧化应激增强。增强的氧化应激会攻击细胞膜上的多不饱和脂肪酸，导致关键物质GSH耗竭，还会激活以caspase‑3为代表的凋亡通路，促使细胞发生程序性死亡^［24-25］。本研究中，H/R导致少突胶质细胞活力下降，细胞凋亡和氧化应激增加，而MSC‑Exo处理可提高细胞活力，防止细胞凋亡与氧化应激的发生。这表明MSC‑Exo可缓解H/R诱导的少突胶质细胞损伤。也有研究发现，脑缺血再灌注损伤后JAK2/STAT3信号通路被异常激活，参与神经元凋亡及炎症反应^［26］。本研究中，MSC‑Exo干预后可抑制JAK2/STAT3信号通路。为进一步探究JAK2/STAT3信号通路在早产儿WMI中的作用，应用JAK2i进行干预，结果显示，JAK2i能够显著抑制JAK2/STAT3信号通路，同时恢复细胞活力，减轻氧化应激程度，这与MSC‑Exo处理的效果一致，提示MSC‑Exo可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路的过度激活来发挥其保护作用，表明JAK2/STAT3信号通路可能是MSC‑Exo发挥神经保护作用的关键信号通路。H/R损伤导致大量炎症因子释放、细胞内氧化物质增加、氧化还原反应失衡等，以上均与铁死亡关系密切^［27-28］。铁死亡是一种由铁超载介导的脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡，近年来已得到广泛研究^［29］。亦有研究指出，抑制JAK2/STAT3信号通路可减少脂质过氧化产物并上调GPX4蛋白表达，从而抑制铁死亡的发生^［30］。然而，MSC‑Exo对早产儿WMI的作用，尤其是在H/R诱导的少突胶质细胞损伤中的作用尚不清楚。为进一步探究MSC‑Exo抑制JAK2/STAT3信号通路的机制是否与铁死亡相关，本研究检测了铁死亡关键蛋白GPX4和TFR的表达，结果显示，MSC‑Exo或JAK2i均可显著抑制铁死亡的发生。以上结果表明，MSC‑Exo通过调控JAK2/STAT3信号通路抑制少突胶质细胞铁死亡，从而减轻早产儿WMI，铁死亡可能是MSC‑Exo保护少突胶质细胞的重要靶点。

综上所述，本研究证实MSC‑Exo具有神经保护作用，与既往MSC‑Exo在其他脑损伤模型中的研究结论一致^{［31‑32］}；本研究首次在少突胶质细胞损伤模型中证实，MSC‑Exo通过JAK2/STAT3信号通路调控铁死亡的保护机制。既往研究多聚焦于神经元或整体动物模型，而本研究以WMI病理进程中的核心效应细胞少突胶质细胞为研究对象，针对性构建早产儿WMI相关的体外损伤模型，不仅填补了MSC‑Exo在少突胶质细胞铁死亡调控领域的研究空白，更从细胞层面为解析早产儿WMI的病理机制、开发靶向干预策略提供了实验依据。然而，本研究仍存在一定局限性：首先，所有实验均在体外细胞层面开展，缺乏动物体内实验及临床样本的验证，后续需构建早产儿WMI动物模型，验证MSC‑Exo的体内保护效应及机制；其次，铁死亡的调控网络复杂，本研究仅检测了GPX4、TFR两个核心标志物，未全面考察其他关键调控因子的作用，后续需系统分析铁死亡相关分子的变化，以完善机制研究；此外，本研究仅聚焦JAK2/STAT3单条通路，未深入探讨该通路与其他铁死亡调控通路的交互作用，后续需进一步开展多通路关联研究。

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