miR⁃146b⁃5p在高氧诱导的新生大鼠肺血管重塑中的作用：基于铁死亡的调控机制

Role of miR-146b-5p in hyperoxia-induced pulmonary vascular remodeling in neonatal rats: mechanisms based on the regulation of ferroptosis

摘要

目的 探讨miR⁃146b⁃5p在高氧诱导的新生大鼠支气管肺发育不良相关肺动脉高压（bronchopulmonary dysplasia⁃associated pulmonary hypertension, BPD⁃PH）肺血管重塑中的作用及机制。 方法 选取32只Sprague⁃Dawley新生大鼠，随机分为常氧组、BPD⁃PH组、过表达组和抑制剂组，每组8只。常氧组于21%氧浓度环境中饲养，其余3组置于85.0%±0.5%的高氧箱中构建BPD⁃PH模型。其中过表达组经尾静脉注射腺病毒ADV1⁃miR⁃146b⁃5p，抑制剂组注射miR‑146b‑5p抑制剂。建模14 d后，采用共聚焦显微镜观察腺病毒在肺组织中的转染效率；采用直接测压法测定右心室收缩压（right ventricular systolic pressure, RVSP），分离右心室组织称重并计算右心室肥厚指数（right ventricular hypertrophy index, RVHI）；苏木精-伊红染色观察肺血管形态并计算血管中膜厚度百分比（medial thickness percentage, MT%）、血管中膜面积百分比（medial area percentage, MA%）；透射电子显微镜观察肺血管内皮细胞线粒体的超微结构；3,3'⁃二氨基联苯胺普鲁士蓝染色和亚铁离子试剂盒检测肺组织铁沉积水平；实时荧光定量PCR检测核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2⁃related factor 2, Nrf2）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）、溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）、长链酰基辅酶A合成酶4（acyl⁃CoA synthetase long⁃chain family member 4, ACSL4）mRNA表达水平，免疫印迹法检测Nrf2、GPX4、SLC7A11、ACSL4蛋白表达水平。 结果 与常氧组比较，BPD⁃PH组新生大鼠RVSP升高，RVHI、MT%、MA%增大，线粒体肿胀，铁沉积增多，Nrf2、GPX4、SLC7A11 mRNA及蛋白表达下调，ACSL4 mRNA及蛋白表达上调（P<0.05）。与BPD‑PH组比较，过表达组新生大鼠RVSP升高，RVHI、MT%、MA%增大，线粒体重度肿胀，铁沉积明显增多，Nrf2、GPX4、SLC7A11 mRNA及蛋白表达下调，ACSL4 mRNA及蛋白表达上调（P<0.05）；抑制剂组RVSP降低，RVHI、MT%、MA%减小，线粒体肿胀缓解，铁沉积减少，Nrf2、GPX4、SLC7A11 mRNA及蛋白表达上调，ACSL4 mRNA及蛋白表达下调（P<0.05）。 结论 在高氧暴露下，miR⁃146b⁃5p过表达可促进新生大鼠肺血管重塑，其机制可能与抑制Nrf2/GPX4信号通路、调控铁死亡有关。

Abstract

Objective To investigate the role and mechanism of miR-146b-5p in pulmonary vascular remodeling in neonatal rats with bronchopulmonary dysplasia-associated pulmonary hypertension (BPD-PH) induced by hyperoxia. Methods Thirty-two Sprague-Dawley neonatal rats were randomly assigned to normoxia group, BPD-PH group, overexpression group, and inhibitor group (n=8 per group). The normoxia group was raised in 21% oxygen, while the other groups were exposed to 85.0%±0.5% hyperoxia to induce BPD-PH. The overexpression group received tail vein injection of ADV1-miR-146b-5p adenovirus; the inhibitor group received miR-146b-5p inhibitor injections. After 14 days, adenovirus transfection efficiency in lung tissue was confirmed by confocal microscopy. Right ventricular systolic pressure (RVSP) was measured by direct manometry. Right ventricular hypertrophy index (RVHI) was calculated by weighing isolated ventricular tissues. Hematoxylin-eosin staining was used to assess pulmonary vascular morphology, and medial thickness percentage (MT%) and medial area percentage (MA%) of pulmonary vessels were calculated. Mitochondrial ultrastructure of pulmonary vascular endothelial cells was observed by transmission electron microscopy (TEM). Iron deposition in lung tissue was detected by DAB Prussian blue staining and ferrous ion colorimetric assay. Quantitative real-time PCR was used to measure mRNA expression levels of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), glutathione peroxidase 4 (GPX4), solute carrier family 7 member 11 (SLC7A11), and acyl-CoA synthetase long-chain family member 4 (ACSL4). Protein expression levels of these molecules were detected by Western blotting. Results Compared with the normoxia group, the BPD-PH group showed significantly increased RVSP, RVHI, MT%, and MA% (P<0.05), swollen mitochondria, increased iron deposition, downregulated mRNA and protein expression of Nrf2, GPX4, and SLC7A11, and upregulated expression of ACSL4 (P<0.05). Compared with the BPD-PH group, the overexpression group exhibited further increases in RVSP, RVHI, MT%, and MA%, severe mitochondrial swelling, significantly elevated iron deposition, decreased Nrf2, GPX4, and SLC7A11 mRNA and protein levels, and increased ACSL4 expression (P<0.05). In contrast, the inhibitor group demonstrated decreased RVSP, RVHI, MT%, and MA%, alleviated mitochondrial swelling, reduced iron deposition, upregulated mRNA and protein levels of Nrf2, GPX4, and SLC7A11, and downregulated mRNA and protein levels of ACSL4 (P<0.05). Conclusions Overexpression of miR-146b-5p promotes pulmonary vascular remodeling in neonatal rats exposed to hyperoxia, likely through inhibition of the Nrf2/GPX4 signaling pathway and regulation of ferroptosis.

Graphical abstract

关键词

支气管肺发育不良相关肺动脉高压 / miR⁃146b⁃5p / 肺血管重塑 / 铁死亡 / 新生大鼠

Key words

Bronchopulmonary dysplasia-associated pulmonary hypertension / miR-146b-5p / Pulmonary vascular remodeling / Ferroptosis / Neonatal rat

新生儿重症医学的发展显著提升了超早产儿与极低出生体重儿的存活率，但也使得支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD）的发病率随之升高。支气管肺发育不良相关肺动脉高压（bronchopulmonary dysplasia⁃associated pulmonary hypertension, BPD⁃PH）作为BPD的严重并发症，已成为影响患儿远期预后的重要因素^［1⁃4］。BPD⁃PH病理生理基础主要包括肺血管重塑^［5］、发育异常及气道高反应性。目前因缺乏有效的早期干预靶点与治疗策略，该病仍是新生儿呼吸领域亟待解决的临床难题^［6］。

miR⁃146b⁃5p是微小RNA家族的重要成员，参与调控细胞增殖、凋亡、炎症反应等多种生物学过程^［7］。已有研究显示，miR⁃146b⁃5p在高氧性肺损伤小鼠模型中异常高表达，并可通过Wnt信号通路参与BPD的发生发展^［8］。

研究证实，高氧诱导的小鼠肺损伤存在氧化应激失衡与铁代谢紊乱，二者是铁死亡的关键诱发因素^［9］。铁死亡为脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡，其调控机制涉及多条信号通路及关键蛋白^［10-13］。其中，核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2⁃related factor 2, Nrf2）作为抗氧化核心转录因子，可通过激活下游靶基因抑制脂质过氧化，进而拮抗铁死亡；胱氨酸转运体溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）为谷胱甘肽（glutathione, GSH）合成提供底物，谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）则依赖GSH清除脂质过氧化物，二者共同构成铁死亡核心抑制轴；长链酰基辅酶A合成酶4（acyl⁃CoA synthetase long⁃chain family member 4, ACSL4）可通过调控不饱和脂肪酸代谢、提高脂质过氧化底物水平促进铁死亡。Li等^［14］研究证实，miR⁃146b⁃5p可靶向含溴结构域蛋白4调控Nrf2信号通路，进而发挥细胞保护作用。

尽管miR⁃146b⁃5p对Nrf2通路的调控作用，以及Nrf2/GPX4轴在BPD铁死亡中的作用已得到证实，但miR⁃146b⁃5p能否通过Nrf2/GPX4轴调控铁死亡，并参与BPD‑PH的病理生理过程，目前尚未见报道。据此，本研究提出假设：miR⁃146b⁃5p可能通过调控铁死亡介导肺血管结构损伤、促进肺血管重塑，进而参与BPD⁃PH的发生与发展。

1 材料与方法

1.1　主要仪器及试剂

主要仪器：BL⁃420S生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司），S1006⁃S常量氧浓度控制系统（上海玉研仪器有限公司），HT7800透射电子显微镜（北京日立科学仪器有限公司），BX61WI激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司），Nikon Eclipse E100光学显微镜（日本Nikon公司）等。

主要试剂：miR⁃146b⁃5p过表达腺病毒与miR‑146b‑5p抑制剂（上海吉玛制药技术有限公司）；S1066S亚铁离子检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Nrf2多克隆抗体、GPX4单克隆抗体、SLC7A11单克隆抗体、ACSL4单克隆抗体（杭州华安生物技术有限公司，抗体货号分别为ER1706‑41、ET1706‑45、HA600098、HA750469）。引物均由上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.2　实验分组及处理

取日龄12 h内的Sprague⁃Dawley新生大鼠32只，随机分为4组（常氧组、BPD⁃PH组、过表达组和抑制剂组，n=8）。建模前12 h，过表达组经尾静脉注射腺病毒ADV1⁃miR⁃146b⁃5p（100 μL，滴度1×10¹¹ PFU/mL），抑制剂组注射miR⁃146b⁃5p抑制剂（按当天所称的乳鼠体重，80 mg/kg^［8］，生理盐水溶解），其余2组给予等体积生理盐水。腺病毒及抑制剂剂量参照文献［8］并经预实验优化，以确保miR⁃146b⁃5p稳定过表达或有效抑制。本研究经新疆医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准（审批号：IACUC⁃JT⁃20250114‑09），动物使用许可证号：SCXK（新）2018‑0003。

1.3　构建BPD⁃PH新生大鼠模型

参照既往研究方法^［15］，构建高氧诱导新生大鼠BPD⁃PH模型。常氧组置于21%氧浓度环境中饲养；BPD⁃PH组、过表达组及抑制剂组新生大鼠与母鼠共同置于常压高氧箱，每12 h与常氧组母鼠互换以避免氧中毒；氧浓度由氧浓度控制仪维持在85.0%±0.5%，除湿风扇自动排出多余CO₂与水蒸气，昼夜节律12 h/12 h，环境温度25~28 ℃，相对湿度55%~60%。常氧组除氧浓度外，其余饲养条件与其他3组均保持一致。实验期间若新生大鼠死亡，及时补充相同条件新生大鼠，各组均于建模14 d后取材。本研究中所有实验均进行3次独立重复。

1.4　评估腺病毒在肺组织中的转染效果

建模14 d后，取各组新生大鼠右肺组织，经多聚甲醛固定10 h，脱水后以铝箔避光包裹，包埋制备冰冻切片；切片复温后用丙酮固定，DAPI染色并封片，采用共聚焦显微镜观察腺病毒载体绿色荧光蛋白的表达。左肺组织于-80 ℃冻存，采用实时荧光定量PCR检测miR⁃146b⁃5p转录水平，引物序列见表1。

1.5　直接测压法测定各组新生大鼠右心室收缩压，称重右心室并计算右心室肥厚指数

参照课题组前期方法^［16-17］，建模14 d后以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，气管切开插管并连接呼吸机；取腹正中切口，暴露膈肌。采用预充肝素生理盐水的4.5号头皮针于心尖部进行穿刺，经三通阀连接压力传感器，使用BL⁃420S系统记录右心室收缩压（right ventricular systolic pressure, RVSP），反映肺动脉收缩压。测压后放血处死大鼠，剥离心房与大血管，分离右心室并吸干称重，计算右心室肥厚指数（right ventricular hypertrophy index, RVHI），以右心室壁重量与左心室壁和室间隔重量之和的比值表示。

1.6　观察各组新生大鼠肺血管并计算血管中膜厚度百分比、血管中膜面积百分比

收集各组大鼠右肺组织，制备石蜡切片，并行苏木精-伊红染色。每张切片随机选取8支直径100~150 μm的肺动脉，于光学显微镜下观察血管形态，采用Image J软件测定肺血管重塑指标：血管中膜厚度百分比（medial thickness percentage, MT%）=［（血管总直径-管腔直径）/血管总直径］×100%，血管中膜面积百分比（medial area percentage, MA%）=（血管中膜面积/血管总横截面积）×100%。

1.7　透射电子显微镜观察各组新生大鼠肺血管内皮细胞线粒体的超微结构

取各组新生大鼠肺组织，经电镜固定液固定后制备电镜包埋块；先切0.8 μm半薄切片，甲苯胺蓝染色后再切成90 nm超薄切片，铜网裱贴。经乙酸铀-柠檬酸铅电子染色后，采用透射电子显微镜观察肺血管内皮细胞线粒体的超微结构。

1.8　3,3'⁃二氨基联苯胺普鲁士蓝染色和亚铁离子试剂盒检测各组新生大鼠肺组织中的铁沉积

石蜡切片经脱蜡至水后，滴加1∶1配制的Perls染色液孵育20 min；蒸馏水冲洗，3,3'⁃二氨基联苯胺（3,3'⁃diaminobenzidine, DAB）普鲁士蓝显色，苏木精复染1 min；常规脱水、透明、封片，光镜下观察并采集图像。取右肺组织于4 ℃匀浆，离心后取上清并测定蛋白浓度；绘制铁离子标准曲线，采用酶标仪检测593 nm波长处吸光度，按公式 ［亚铁离子浓度（nmol/mg）=样品浓度×总稀释倍数×组织裂解总体积/样品质量］计算亚铁离子含量。

1.9　实时荧光定量PCR检测各组新生大鼠肺组织Nrf2、GPX4、SLC7A11、ACSL4的mRNA水平

各组大鼠肺组织匀浆后，采用TRIzol法提取总RNA，通过实时荧光定量PCR检测基因表达。反应条件：95 ℃预变性10 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40个循环。采用2^-ΔΔCT法计算目的基因相对转录水平。引物序列见表1。

1.10　免疫印迹法检测各组新生大鼠肺组织Nrf2、GPX4、SLC7A11、ACSL4的蛋白表达

采用RIPA裂解液提取肺组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜及封闭后，分别加入Nrf2（1∶1 000）、GPX4（1∶1 000）、SLC7A11（1∶1 000）、ACSL4（1∶1 000）及GAPDH（1∶5 000）一抗，4 ℃孵育过夜。次日孵育二抗2 h，洗涤后曝光显影。采用Image J软件以积分光密度为测量模式，滚动球半径50像素扣除背景，以GAPDH为内参计算目的蛋白相对表达量。

1.11　统计学分析

采用SPSS 27.0软件进行统计学分析，采用GraphPad Prism 10.1.2软件绘图。计量资料以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时组间两两比较采用LSD‑t检验，方差不齐时采用Tamhane's T2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　腺病毒载体转染效果鉴定

实验期间，各组新生大鼠均存活，未出现死亡。激光共聚焦显微镜下，过表达组肺组织支气管黏膜与肺泡可见明显散在绿色荧光，其余3组仅见蓝色细胞核荧光，见图1。实时荧光定量PCR结果显示，常氧组、BPD⁃PH组、过表达组和抑制剂组miR⁃146b⁃5p转录水平分别为1.06±0.10、3.85±0.22、7.24±0.23、2.50±0.17，差异有统计学意义（F=1 592.988，P<0.001）。组间两两比较显示，与常氧组相比，BPD⁃PH组、过表达组和抑制剂组miR⁃146b⁃5p表达上调（P<0.05）；与BPD⁃PH组相比，过表达组新生大鼠miR⁃146b⁃5p表达上调（P<0.05），抑制剂组新生大鼠miR⁃146b⁃5p表达下调（P<0.05）。

2.2　miR⁃146b⁃5p对新生大鼠右心室及肺血管重塑指标的影响

与常氧组相比，BPD⁃PH组新生大鼠RVSP升高，RVHI、MT%、MA%增大（P<0.05）。与BPD⁃PH组相比，过表达组RVSP升高，RVHI、MT%、MA%增大（P<0.05）；抑制剂组RVSP降低，RVHI、MT%、MA%减小（P<0.05）。见表2。苏木精-伊红染色结果显示，常氧组肺动脉管腔通畅无狭窄、管壁光滑、厚薄均匀；BPD‑PH组肺动脉管壁明显增厚、管腔狭窄，病理改变显著；过表达组肺动脉管壁增厚及管腔狭窄程度明显重于其余3组；抑制剂组肺动脉仍可见管壁增厚、管腔狭窄，但病变程度较BPD‑PH组减轻。见图2。

2.3　miR⁃146b⁃5p对新生大鼠肺血管内皮细胞线粒体的影响

常氧组肺血管内皮细胞线粒体形态完整，膜结构清晰、嵴突清晰可辨；BPD‑PH组线粒体肿胀、嵴紊乱伴局部断裂；过表达组线粒体重度肿胀，部分膜结构破损，嵴广泛破坏；抑制剂组线粒体损伤程度减轻，仅见轻度肿胀、膜局部破损及嵴缺失。见图3。

2.4　miR⁃146b⁃5p对各新生大鼠肺组织中铁沉积的影响

常氧组大鼠肺组织未见棕色颗粒沉积，亚铁离子水平处于正常范围。与常氧组比较，BPD‑PH组肺组织可见棕色颗粒沉积，亚铁离子含量显著升高（P<0.05）；与BPD‑PH组比较，过表达组颗粒沉积增多，亚铁离子水平进一步升高（P<0.05），抑制剂组颗粒沉积减少、亚铁离子含量显著降低（P<0.05）。见图4、表3。

2.5　miR⁃146b⁃5p对各组新生大鼠肺组织Nrf2、GPX4、SLC7A11、ACSL4 mRNA表达的影响

与常氧组相比，BPD⁃PH组新生大鼠Nrf2、GPX4、SLC7A11 mRNA水平下调，ACSL4 mRNA水平上调（P<0.05）；与BPD⁃PH组相比，过表达组Nrf2、GPX4、SLC7A11 mRNA水平下调，ACSL4 mRNA水平上调（P<0.05）；抑制剂组Nrf2、GPX4、SLC7A11 mRNA水平上调，ACSL4 mRNA水平下调（P<0.05）。见表3。

2.6　miR⁃146b⁃5p对各组新生大鼠肺组织Nrf2、GPX4、SLC7A11、ACSL4蛋白表达的影响

与常氧组相比，BPD⁃PH组新生大鼠Nrf2、GPX4、SLC7A11蛋白表达下调，ACSL4蛋白表达上调（P0.05）；与BPD⁃PH组相比，过表达组Nrf2、GPX4、SLC7A11蛋白表达下调，ACSL4蛋白表达上调（P0.05），抑制剂组Nrf2、GPX4、SLC7A11蛋白表达上调，ACSL4蛋白表达下调（P0.05）。见图5、表4。

3 讨论

BPD‑PH是导致早产儿晚期死亡及远期心肺功能障碍的重要原因，其核心病理特征为肺血管重塑，可引发肺动脉压力持续升高与右心负荷增加。目前临床以利尿剂减轻右心负荷、磷酸二酯酶抑制剂短期降低肺动脉压等对症治疗为主^［18］，难以逆转已发生的肺血管重塑，亟需探寻新的干预靶点以改善患儿预后。

表观遗传学为阐释非DNA序列依赖的基因表达调控机制提供了重要理论依据，微小RNA作为关键非编码RNA，在表观遗传调控网络中占据重要地位，且与BPD‑PH的发生发展存在密切关联^［19］。本研究显示，新生大鼠经高氧暴露14 d后，肺组织miR‑146b‑5p表达上调，伴肺血管重塑、右心室肥厚及肺动脉压力显著升高；过表达miR‑146b‑5p可进一步加重上述损伤，呈正向调控作用；而抑制miR‑146b‑5p表达则可显著改善相关指标。提示miR‑146b‑5p在高氧诱导的BPD‑PH中发挥促病效应，与既往相关研究结果^［8］一致。

铁死亡为新型程序性细胞死亡方式，核心机制为GSH‑GPX4抗氧化系统失衡，引发脂质活性氧大量堆积，进而破坏细胞膜完整性并诱发线粒体结构异常^［20］。研究证实，硫氧还蛋白相互作用蛋白可通过下调SLC7A11/GPX4通路介导肺组织细胞铁死亡，而铁死亡抑制剂可减轻肺损伤^［21］。在少突胶质前体细胞氧糖剥夺模型中，miR‑146b‑5p可通过靶向含溴结构域蛋白4调控Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1/Nrf2/GPX4通路，进而抑制铁死亡。鉴于miR‑146b‑5p的靶基因具有细胞与疾病特异性，其在BPD‑PH中的调控通路仍需进一步验证。本研究电镜观察结果显示，BPD‑PH组、过表达组及抑制剂组肺血管内皮细胞线粒体均出现铁死亡样形态学损伤，其中过表达组损伤最为显著。据此推测，miR‑146b‑5p可能通过调控线粒体功能或铁死亡过程参与肺血管重塑，进而初步阐明其在高氧诱导的新生大鼠肺血管重塑中的作用。

本研究存在局限性：仅在动物模型水平验证miR‑146b‑5p的作用，未开展细胞实验与临床样本验证；相关靶点与通路的临床转化仍需深入探索。未来可开发雾化吸入靶向制剂^［22］或靶向纳米递送系统^［23］实现局部高效干预，以减轻肺血管重塑与肺泡损伤，为临床转化提供实验依据。

综上，本研究表明，高氧诱导miR‑146b‑5p过表达可加剧新生大鼠肺血管重塑，其机制可能与抑制Nrf2/GPX4通路、促进铁死亡有关，为BPD‑PH的机制研究与干预策略提供了新思路。

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