小檗碱通过TLR4/MyD88/NF‑κB/NLRP3通路改善新生儿坏死性小肠结肠炎相关脑损伤机制研究

Berberine attenuates necrotizing enterocolitis-associated brain injury via the TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 pathway

摘要

目的 探讨小檗碱（berberine, BBR）对新生儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）相关脑损伤的保护作用及其机制。 方法 构建NEC小鼠模型，将小鼠分为对照组、模型组、BBR低剂量组（2.5 mg/kg）、BBR高剂量组（5 mg/kg），每组24只。记录小鼠体重变化及生存情况；采用苏木精-伊红染色观察肠道、脑组织病理损伤程度，尼氏染色评估海马神经元损伤情况，免疫组化法检测海马小胶质细胞活化水平，酶联免疫吸附试验检测肠、脑脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）含量，蛋白质印迹法（Western blot, WB）与荧光定量聚合酶链式反应法检测脑组织肿瘤坏死因子‑α、白细胞介素（interleukin, IL）‑6、IL‑1β mRNA及蛋白表达水平；WB法检测Toll样受体4 （Toll‑like receptor 4, TLR4）/髓系分化初级反应蛋白质88（myeloid differentiation primary response 88, MyD88）/核因子κB（nuclear factor‑κB, NF‑κB）信号通路及核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3（nucleotide-binding domain leucine-rich repeat and pyrin domain-containing receptor 3, NLRP3）炎症小体相关蛋白、血脑屏障紧密连接相关蛋白表达水平；采用旷场实验、新物体识别实验、Y迷宫实验及Morris水迷宫实验评估小鼠远期神经行为功能。将BV2小胶质细胞随机分为空白组、LPS组、LPS+BBR组、LPS+瑞沙托维（Resatorvid, TAK‑242）组（n=3）。采用CCK‑8法检测细胞活力，WB法检测各组细胞炎症通路蛋白表达水平。 结果 与模型组比较，BBR低剂量组、BBR高剂量组肠道与脑组织病理改变较模型组减轻，肠道病理评分、第3~5天逃避潜伏期、活化表型的离子钙接头蛋白分子1阳性小胶质细胞数量及肿瘤坏死因子‑α、IL‑6、IL‑1β mRNA和蛋白表达水平降低（P<0.05），自发交替率升高（P<0.05）；BBR高剂量组肠、脑LPS水平及脑组织TLR4/MyD88/NF‑κB信号通路、NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平降低（P<0.05），造模后第1~3天体重、中央区行进距离、中央区停留时间、测试期识别指数、平台穿越次数、目标象限停留时间百分比、脑组织紧密连接相关蛋白表达升高（P<0.05）。与LPS组比较，LPS+BBR组、LPS+TAK‑242组TLR4/MyD88/NF‑κB信号通路及NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平降低（P<0.05）。 结论 BBR可减轻NEC模型小鼠脑损伤并改善远期神经功能，高剂量作用更显著；其机制可能与维持血脑屏障完整性、抑制TLR4/MyD88/NF‑κB信号通路及NLRP3炎症小体活化有关。

Abstract

Objective To investigate the protective effects and underlying mechanisms of berberine (BBR) on brain injury related to neonatal necrotizing enterocolitis (NEC). Methods An NEC mouse model was established and mice were assigned to control, model, low-dose BBR (2.5 mg/kg), and high-dose BBR (5 mg/kg) groups (n=24 per group). Body weight and survival were recorded. Hematoxylin-eosin staining was performed to assess pathological damage in intestinal and brain tissues; Nissl staining was performed to evaluate neuronal injury in the hippocampus; immunohistochemistry was conducted to detect microglial activation in the hippocampus. Lipopolysaccharide (LPS) levels in the intestine and brain were measured by ELISA. Western blot and quantitative PCR were used to quantify the protein and mRNA expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), and interleukin-1β (IL-1β) in brain tissue. Western blot was further used to examine the protein expression related to the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway, NLRP3 inflammasome, and blood-brain barrier (BBB) tight junction proteins (ZO-1, Occludin, Claudin-5). Neurobehavioral functions were evaluated by the open field, novel object recognition, Y-maze, and Morris water maze tests. In vitro, BV2 microglial cells were divided into control, LPS, LPS+BBR, or LPS+TAK-242 (TLR4 inhibitor) groups (n=3 per group). Cell viability was assessed by CCK-8 assay and inflammatory signaling proteins were measured by Western blot. Results Compared with the model group, both BBR doses alleviated intestinal and brain pathology; the intestinal pathology score, escape latency on days 3 to 5, number of activated microglia (immunoreactive for ionized calcium-binding adaptor molecule 1), and TNF-α, IL-6, IL-1β mRNA/protein levels decreased significantly (P<0.05), while the spontaneous alternation rate increased (P<0.05). High-dose BBR reduced intestinal and brain LPS levels and downregulated the TLR4/MyD88/NF-κB pathway and NLRP3 inflammasome-related protein expression in the brain (P<0.05). During days 1 to 3 after NEC induction, body weight, central zone movement distance, central zone residence time, recognition index in the testing phase, platform crossings, percentage of time spent in the target quadrant, and expression of BBB tight junction proteins increased significantly in the high-dose group (P<0.05). In vitro, LPS+BBR and LPS+TAK-242 treatments reduced the protein expression related to the TLR4/MyD88/NF-κB pathway and NLRP3 inflammasome compared with LPS alone (P<0.05). Conclusions BBR can alleviate brain injury in NEC model mice and improve long-term neurological outcomes dose-dependently. These effects likely involve preservation of BBB integrity and suppression of microglial activation via inhibition of the TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

小檗碱 / 坏死性小肠结肠炎 / 脑损伤 / 血脑屏障 / 小鼠 / 小胶质细胞

Key words

Berberine / Necrotizing enterocolitis / Brain injury / Blood-brain barrier / Mouse / Microglia

新生儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是新生儿期严重的胃肠道疾病，病死率高，多见于早产儿，出生体重<1 500 g的患儿发病率可达10%^［1-2］。随着新生儿救治水平提高，NEC患儿存活率上升，但约40%并发神经发育障碍，遗留运动、认知缺陷，加重家庭与社会负担^［3］。

NEC相关脑损伤的发病机制尚未完全阐明。既往研究表明，小胶质细胞活化介导的神经炎症是诱发NEC相关脑损伤及远期神经功能障碍的核心机制^［4］。小胶质细胞活化可通过Toll样受体4（Toll‑like receptor 4, TLR4）下游通路及核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3（nucleotide‑binding domain leucine‑rich repeat and pyrin domain‑containing receptor 3, NLRP3）炎症小体，诱发中枢过度炎症反应，参与各类脑损伤病理进程^［5-7］。因此，TLR4通路及NLRP3炎症小体可能是防治脑损伤的重要靶点。

小檗碱（berberine, BBR）是从黄连、黄柏等中药中提取的异喹啉类生物碱，具备抗炎、抗氧化、免疫调节活性，因其强大的抗炎作用而被广泛应用于感染性腹泻、胃肠炎、肠道炎性病变等多种胃肠病症的治疗^［8-10］。近年来，研究发现BBR可通过保护血脑屏障（blood‑brain barrier, BBB）、抑制神经炎症缓解阿尔茨海默病、脑出血等中枢病变^［11-12］。然而，BBR在NEC相关脑损伤中的作用尚不明确。本研究假设BBR可通过维持BBB完整性、抑制小胶质细胞TLR4/髓系分化初级反应蛋白质88（myeloid differentiation primary response 88, MyD88）/核因子κB（nuclear factor‑κB, NF‑κB）/NLRP3通路，减轻NEC相关脑损伤并改善远期神经功能。本研究通过构建NEC小鼠模型和脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导小鼠BV2小胶质细胞炎症模型，明确BBR的神经保护效应并解析其分子机制，为NEC相关脑损伤保护策略提供实验依据，进而为改善NEC、败血症等新生儿重症感染相关中毒性脑病预后提供新思路。

1 材料与方法

1.1　实验动物

SPF级健康成年C57BL/6小鼠购自重庆医科大学实验动物中心，饲养于重庆医科大学附属儿童医院动物实验中心，饲养环境符合SPF级动物饲养标准。雌雄小鼠按1∶2比例合笼，选取7日龄新生仔鼠用于后续实验。本实验已通过重庆医科大学附属儿童医院动物实验中心伦理审查委员会审批（CHCMU‑IACUC20250318007）。

1.2　细胞与主要试剂

小鼠BV2小胶质细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；BBR（盐酸小檗碱单体，纯度99.92%，货号HY‑18258）、TLR4抑制剂瑞沙托维（resatorvid, TAK‑242）购自美国MedChemExpress公司；LPS购自美国Sigma‑Aldrich公司；小鼠LPS酶联免疫吸附试验（enzyme‑linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司；CCK‑8试剂盒购自重庆泽恒生物技术有限公司；抗NLRP3抗体购自美国Novus Biologicals公司；抗凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis‑associated speck‑like protein containing a CARD, ASC）抗体购自江苏亲科生物研究中心有限公司；抗白细胞介素（interleukin, IL）‑6、抗IL‑1β、抗肿瘤坏死因子‑α（tumor necrosis factor‑α, TNF‑α）、抗消皮素D N端片段（gasdermin D N‑terminal fragment, GSDMD‑N）抗体购自杭州华安生物技术有限公司；抗离子钙接头蛋白分子1（ionized calcium‑binding adaptor molecule 1, Iba‑1）、抗咬合蛋白（Occludin）、抗闭合蛋白‑5（Claudin‑5）、抗MyD88、抗磷酸化核因子κB p65（phospho‑nuclear factor‑κB p65，p‑NF‑κB p65）、抗β‑肌动蛋白（β‑actin）抗体购自成都正能生物技术有限责任公司；抗兔免疫组化检测试剂盒，抗闭锁小带蛋白1（zonula occludens‑1, ZO‑1）、抗TLR4、抗NF‑κB p65、抗胱天蛋白酶1（caspase‑1）p20抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3　动物分组及处理

选取7日龄C57BL/6同窝新生小鼠，随机分为对照组、模型组、BBR低剂量组和BBR高剂量组，每组24只。对照组全程采用母鼠母乳喂养，其余各组通过人工喂养联合缺氧、冷刺激干预3 d，建立NEC小鼠模型^［13］。建模期间每日监测体重、症状及存活情况。BBR低剂量组、BBR高剂量组小鼠分别腹腔注射2.5 mg/kg、5 mg/kg BBR，每日1次；模型组腹腔注射等体积磷酸盐缓冲液。BBR给药剂量参照预实验及既往文献确定^［14］。

1.4　细胞培养和处理

采用CCK‑8法筛选BBR干预浓度：BV2细胞经0~20 μmol/L BBR梯度浓度处理24 h后，加入含10% CCK‑8的工作液，于37℃避光孵育2 h，通过酶标仪检测450 nm波长处吸光度值。后续实验选取对数生长期细胞，随机分为空白组、LPS组、LPS+BBR组、LPS+TAK‑242组（n=3）。LPS+BBR组、LPS+TAK‑242组分别采用BBR、5 μmol/L TAK‑242预处理1 h^［15］；除空白组不作处理外，其余各组均以1 μg/mL LPS刺激23 h。

1.5　行为学实验

建模后将小鼠与母鼠合笼饲养，于小鼠出生后4~6周开展行为学测试；实验前小鼠适应环境30 min，每次检测后采用75%乙醇清洁装置以消除气味干扰。

1.5.1　旷场实验

将小鼠置于50 cm×50 cm旷场装置中心，自由探索10 min。采用ANY行为学分析软件记录小鼠活动轨迹及相关指标。

1.5.2　新物体识别实验

实验分训练期和测试期。训练期放置两个相同物体，小鼠自由探索5 min，4 h后进入测试期，替换其中一个物体为新物体，记录小鼠5 min内探索行为。计算辨别指数：辨别指数=（新物体探索时间-旧物体探索时间）/总探索时间。

1.5.3 Y迷宫实验

将小鼠放入Y迷宫装置自由探索8 min，统计自发交替次数（A→B→C顺序进臂记为1次）。计算自发交替率：自发交替率=自发交替次数/（总进臂次数-2）×100%。

1.5.4　Morris水迷宫实验

小鼠在水迷宫装置中适应性训练1 d后，开展5 d定位航行实验，记录逃避潜伏期。间隔1 d后行空间探索实验，采用ANY行为学分析软件记录小鼠平台穿越次数、目标象限停留时间百分比。

1.6　苏木精-伊红染色及病理评分

小鼠肠、脑组织经4%多聚甲醛固定24 h、石蜡包埋后，制备4 μm切片。切片经脱蜡、水化、染色、脱水、透明及中性树脂封片，采用玻片扫描仪采集图像。参照文献报道的NEC病理评分标准^［16］，以双盲法评估肠道组织损伤程度：0分，无损伤；1分，上皮脱落；2分，绒毛中度坏死；3分，绒毛完全坏死；4分，肠壁全层坏死，评分≥2分为NEC。

1.7　尼氏染色

脑组织石蜡切片经脱蜡、水化后，置于50 ℃尼氏染色液中孵育1 h，经分化、脱水、透明、封片，通过玻片扫描仪采集图像。

1.8　ELISA检测

肠、脑组织加入裂解液冰上研磨、超声破碎，4 ℃、7 200 r/min离心5 min，收集上清液；蛋白定量后按试剂盒说明书检测肠、脑组织LPS水平，结果以总蛋白浓度校正。

1.9　Iba‑1免疫组化染色

脑组织石蜡切片经抗原修复、封闭处理后，加入Iba‑1一抗（1∶200）孵育；后续经二抗孵育、DAB显色、苏木精复染并封片；使用玻片扫描仪采集图像。

1.10　荧光定量聚合酶链式反应

采用Trizol法提取小鼠脑组织总RNA并反转录合成cDNA，以β‑actin为内参基因，扩增Il‑6、Tnf‑α、Il‑1β目的基因。各基因引物序列如下。Il‑6正义链：5'‑CATGTTCTCTGGGAAATCGTG‑3'，反义链：5'‑TTCTGCAAGTGCATCATCG‑3'；Tnf‑α正义链：5'‑ATCGGTCCCCAAAGGGATGA‑3'，反义链：5'‑GCTACAGGCTTGTCACTCGAA‑3'；Il‑1β正义链：5'‑TGGTGTGTGACGTTCCCATT‑3'，反义链：5'‑CAGCACGAGGCTTTTTTGTTG‑3'；β‑actin正义链：5'‑GTGACGTTGACATCCGTAAAGA‑3'，反义链：5'‑GCCGGACTCATCGTACTCC‑3'。采用2^-△△Ct法计算目的基因mRNA的相对表达量。

1.11　蛋白质印迹

提取组织与细胞总蛋白并定量，经电泳、转膜、封闭后孵育一抗［TLR4（1∶1 000）、MyD88（1∶1 000）、NF‑κB p65（1∶1 000）、p‑NF‑κB p65（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶500）、caspase‑1 p20（1∶2 000）、GSDMD‑N（1∶2 000）、IL‑6（1∶500）、TNF‑α（1∶500）、IL‑1β（1∶500）、ZO‑1（1∶5 000）、Occludin（1∶1 000）、Claudin‑5（1∶1 000）、β‑actin（1∶5 000）］，随后孵育二抗（1∶5 000），化学发光法显影，采用ImageJ软件分析条带灰度值。

1.12　统计学分析

采用GraphPad Prism 10.1.2软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量数据以均值±标准差（\overline{x}\pm s）表示。小鼠连续多时间点监测的体重资料采用重复测量方差分析，球形检验不满足球形假设时采用格林豪斯-盖斯勒法校正，检验组别、时间主效应及二者交互作用，交互效应有统计学意义时再分时间点进行组间两两比较。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey's HSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　BBR对NEC小鼠一般情况和肠道的影响

模型组小鼠造模后第1~3天体重较对照组降低（P<0.05）；与模型组比较，BBR高剂量组小鼠造模后第2~3天体重增加，BBR低剂量组小鼠仅造模后第3天体重增加（P<0.05）；重复测量方差分析显示，组别、时间及二者交互效应差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

与对照组比较，模型组小鼠肠道积气明显、肠组织结构破坏，肠道病理评分升高（分别为3.2±0.8、0.3±0.5，P<0.05）；与模型组比较，BBR低剂量组、BBR高剂量组肠道积气减轻、病理损伤减轻，肠道病理评分降低（分别为1.8±0.8、1.5±0.5，P<0.05）。见图1。随建模时间延长，模型组小鼠陆续出现腹胀、腹泻、活动减少，部分小鼠死亡。生存率随BBR剂量升高逐步回升：对照组为100%，模型组为60%，BBR低剂量组为80%，高剂量组为93.3%。

2.2　BBR对NEC小鼠急性期脑组织损伤的影响

苏木精-伊红染色与尼氏染色结果显示，对照组小鼠大脑皮层及海马区细胞形态规则、排列整齐，神经元尼氏小体丰富；模型组细胞形态异常、排列紊乱，尼氏小体数量较对照组减少；与模型组相比，BBR低剂量组、BBR高剂量组细胞形态与排列改善，尼氏小体数量增多，脑组织病理损伤减轻，BBR高剂量组改善效果更佳。见图2。

2.3　BBR对NEC小鼠远期神经功能的影响

旷场实验中，模型组中央区行进距离、停留时间较对照组减少（P<0.05），BBR高剂量组中央区行进距离、中央区停留时间较模型组增加（P<0.05）。新物体识别实验中，各组训练期相同物体探索时间占比差异无统计学意义（P>0.05），模型组、低剂量组测试期识别指数低于对照组，高剂量组测试期识别指数高于模型组（P<0.05）。Y迷宫实验中，模型组自发交替率低于对照组（P<0.05），BBR低剂量组、BBR高剂量组自发交替率高于模型组（P<0.05）。Morris水迷宫实验中，模型组第2~5天逃避潜伏期较对照组增加（P<0.05），BBR低剂量组、BBR高剂量组第3~5天逃避潜伏期较模型组减少（P<0.05）；模型组平台穿越次数、目标象限停留时间百分比较对照组减少（P<0.05），BBR高剂量组平台穿越次数、目标象限停留时间百分比较模型组增加（P<0.05）。见表2、图3。

2.4　BBR对BBB的影响

蛋白质印迹法（Western blot, WB）结果显示，与对照组比较，模型组脑组织ZO‑1、Occludin、Claudin‑5蛋白表达降低（P<0.05）；与模型组比较，BBR高剂量组上述蛋白表达升高（P<0.05），BBR低剂量组上述蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）（表3、图4）。ELISA检测结果显示，模型组肠、脑LPS水平较对照组升高（P<0.05）；与模型组比较，BBR低剂量组仅肠道组织LPS水平降低（P<0.05），BBR高剂量组肠、脑LPS水平降低（P<0.05）（表3）。

2.5　BBR对脑组织小胶质细胞和炎症因子的影响

Iba‑1免疫组化染色结果显示，对照组Iba‑1阳性小胶质细胞呈静息状态；模型组Iba‑1阳性小胶质细胞胞体大而圆、突起分支基本消失，呈阿米巴样活化表型。BBR低剂量组、BBR高剂量组活化表型的Iba‑1阳性小胶质细胞较模型组减少。见图5。

脑组织荧光定量聚合酶链式反应及WB检测结果显示，与对照组比较，模型组IL‑6、TNF‑α、IL‑1β mRNA及蛋白表达水平升高（P<0.05）；与模型组比较，BBR低剂量组、BBR高剂量组上述炎症因子的mRNA及蛋白表达水平降低（P<0.05）。见表4、图6。

2.6　BBR对TLR4/MyD88/NF‑κB/NLRP3通路的影响

脑组织WB检测结果显示，与对照组比较，模型组小鼠脑组织TLR4、MyD88、NF‑κB p65、p‑NF‑κB p65、NLRP3、ASC、caspase‑1 p20、GSDMD‑N蛋白表达升高（P<0.05）；与模型组比较，BBR高剂量组上述蛋白表达降低（P<0.05），BBR低剂量组TLR4、MyD88、NF‑κB p65、p‑NF‑κB p65、NLRP3、caspase‑1 p20蛋白表达降低（P<0.05）。见表5、图7。

CCK‑8结果显示，0.5~10 μmol/L BBR处理细胞24 h后，各组细胞活力均维持在90%以上；其中10 μmol/L组（91.67%±1.16%）细胞活力与0 μmol/L组（101.00%±2.00%）比较差异无统计学意义（P>0.05）；20 μmol/L组（73.33%±4.04%）细胞活力较0 μmol/L组降低（P<0.05）。因此选用10 μmol/L为后续BBR干预浓度。

BV2细胞WB检测结果显示，与空白组比较，LPS组TLR4、MyD88、NF‑κB p65、p‑NF‑κB p65、NLRP3、ASC、caspase‑1 p20、GSDMD‑N蛋白表达升高（P<0.05）；与LPS组比较，LPS+BBR组、LPS+TAK‑242组上述蛋白表达降低（P<0.05）。见表6、图7。

3 讨论

NEC是新生儿期危重胃肠道疾病，肠坏死、穿孔诱发的远期神经后遗症可严重损害患儿生存质量^［17］。早产儿肠道菌群稳态尚未建立，肠道黏膜屏障发育不成熟，NEC发生后肠黏膜完整性受损，诱发肠漏及系统性炎症风暴，是介导远端脑损伤的始动因素^［18-19］。本研究中，NEC模型小鼠出现体重下降、肠道胀气及死亡；组织病理学结果显示，小鼠肠道黏膜基底层断裂、炎症细胞浸润，肠道病理评分≥2分，与既往NEC小鼠模型的病理特征一致^［20］。BBR干预可修复受损肠黏膜、缓解肠道胀气，从根源阻断炎症扩散，是其发挥脑保护作用的重要前提。

BBB是维系中枢神经系统微环境稳态的核心生理屏障，ZO‑1、Occludin、Claudin‑5等紧密连接相关蛋白可调控BBB通透性^［21-22］。NEC引发的全身性炎症可通过氧化应激、炎症信号级联反应下调脑组织紧密连接蛋白表达，破坏BBB功能，为LPS、促炎因子等肠源性有害物质侵入脑组织提供通路^［23］。本研究结果显示，模型组小鼠脑组织中紧密连接相关蛋白表达显著降低，同时脑内LPS蓄积水平上升，间接证实BBB完整性被破坏；BBR干预可上调脑组织紧密连接相关蛋白表达，降低脑内LPS水平，表明BBR可维持BBB结果与功能完整性，阻滞肠源性有害物质侵袭中枢神经系统，发挥神经保护作用。

中枢过度炎症反应是NEC脑损伤及神经功能异常的核心环节，小胶质细胞过度活化是介导该病理过程的关键因素，抑制小胶质细胞过度激活可改善NEC小鼠远期神经预后^［4，24］。小胶质细胞作为中枢固有免疫细胞，可维持中枢微环境稳态；在病理刺激下（如LPS）可被快速激活，分泌大量IL‑1β、TNF‑α、IL‑6等促炎因子，进一步放大神经炎症损伤^［25］。LPS可结合小胶质细胞高表达的TLR4，激活下游MyD88/NF‑κB信号通路，并启动NLRP3炎症小体活化；活化的NLRP3可招募ASC衔接蛋白，组装形成NLRP3炎症小体复合物，进而激活caspase‑1，切割GSDMD生成GSDMD‑N，最终促进促炎因子成熟与释放，形成持续放大的炎症级联反应^［26-28］。已有研究证实，BBR可竞争性结合TLR4胞外结构域，阻断LPS与TLR4相互作用，抑制TLR4/MyD88复合物形成、NF‑κB核转位与NLRP3炎症小体活化，减少促炎因子分泌，与本研究结果一致^［29-30］。本研究结果显示，NEC模型小鼠脑组织小胶质细胞大量活化，TLR4、MyD88、NF‑κB p65、p‑NF‑κB p65、NLRP3、ASC、caspase‑1 p20、GSDMD‑N及下游炎症因子IL‑1β、TNF‑α、IL‑6 mRNA和蛋白表达显著升高；BBR干预可明显抑制小胶质细胞活化，下调TLR4/MyD88/NF‑κB信号通路与NLRP3炎症小体相关蛋白及炎症因子表达。体外BV2小胶质细胞实验进一步验证，BBR可明显抑制LPS诱导的TLR4下游通路激活。远期神经行为学检测结果显示，BBR可有效改善NEC模型小鼠成年后的学习与记忆能力。以上提示BBR可通过抑制TLR4介导的炎症通路缓解中枢炎症损伤，进而改善远期神经功能。

本研究仍存在一定局限性。首先，本研究未阐明BBR通过肠道菌群及其代谢产物调控肠-脑轴的潜在机制，后续可借助16S rRNA测序与代谢组学技术深入探究；其次，本研究仅在细胞层面证实BBR与TLR4抑制剂的保护效应相近，鉴于BBR的多靶点药理特性及体内通路的交叉调控效应，尚不能完全排除其他信号通路协同参与神经保护作用，后续可利用多组学技术解析BBR的调控网络。此外，本研究未开展BBR体内药代动力学监测与长期给药安全性评估，其临床转化仍需药代动力学、毒理学相关研究进一步验证。综上所述，BBR可能通过三重途径发挥神经保护作用：减轻肠道原发损伤、保护BBB结构完整性、抑制小胶质细胞TLR4/MyD88/NF‑κB/NLRP3炎症级联反应，进而减轻NEC相关脑损伤并改善模型小鼠远期神经功能。本研究为防治NEC、新生儿败血症等重症感染相关中毒性脑病提供新的实验依据。

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