B细胞连接蛋白对乳腺癌细胞增殖和转移作用的影响

Effect of B cell junction protein on the proliferation and metastasis of breast cancer cells

摘要

目的 探讨B细胞连接蛋白（BLNK）通过抑制P53对乳腺癌细胞增殖和转移作用的影响。 方法 采用CCK⁃8检测人乳腺癌细胞株 （MCF⁃7）细胞增殖能力，采用细胞划痕实验检测MCF⁃7细胞划痕愈合能力，采用Transwell实验检测MCF⁃7细胞迁移能力，采用Western blotting检测P53、Cleaved⁃caspase 9、Apaf⁃1和Bax蛋白的表达水平。 结果 BLNK组24、48、72、96 h的细胞增殖能力明显高于空白组（P均<0.05）；BLNK沉默组24、48、72、96 h的细胞增殖能力显著低于空白组和BLNK组（P均<0.05）；BLNK组24 h的细胞划痕愈合能力明显高于空白组（P<0.05），BLNK沉默组24 h的细胞划痕愈合能力低于空白组和BLNK组（P均<0.05）；BLNK组的细胞迁移能力明显高于空白组（P<0.05），BLNK沉默组的细胞迁移能力显著低于空白组和BLNK组（P均<0.05）；BLNK组的P53、Cleaved⁃caspase 9、Apaf⁃1的表达水平显著低于空白组（P<0.05），BLNK沉默组的P53、Cleaved⁃caspase 9、Apaf⁃1的表达水平明显高于空白组和BLNK组（P均<0.05）；BLNK组Bax蛋白的表达水平显著高于空白组（P<0.05），BLNK沉默组Bax蛋白的表达水平明显低于空白组和BLNK组（P均<0.05）。 结论 过表达BLNK可以抑制P53的表达水平而促进乳腺癌细胞增殖和转移。

Abstract

Objective To investigate the effect of B cell junction protein （BLNK） on the proliferation and metastasis of breast cancer cells by inhibiting P53. Methods The proliferation of MCF⁃7 cells was detected by CCK⁃8， and the scratch healing ability of MCF⁃7 cells and the migration ability of MCF⁃7 cells were respectively detected by scratch healing test and Transwell test. Western blotting was used to detect the protein expressions of P53， cleaved⁃caspase 9， Apaf⁃1 and Bax. Results The cell proliferation ability of the BLNK group at 24， 48， 72 and 96 h was all significantly higher than that of the control group （all P<0.05）. The cell proliferation ability of the BLNK silence group at 24， 48， 72 and 96 h was significantly lower than that of the blank control group （all P<0.05）. The wound healing ability of the BLNK group at 24 h was obviously higher than that of the blank control group （P<0.05）， but the wound healing ability of the BLNK silence group at 24 h was lower than that of the blank control group and the BLNK group （P<0.05）. The migration ability of the BLNK group was higher than that of the blank control group （P<0.05） ， and the migration ability of the BLNK silence group was significantly lower than that of the blank control group and the BLNK group （all P<0.05）. The expression levels of P53， Cleaved⁃caspase 9 and Apaf⁃1 in the BLNK group were all significantly lower than those of the blank control group （P<0.05）， and the expression levels of P53， Cleaved⁃caspase 9 and Apaf⁃1 in the BLNK silence group were all significantly higher than those of the blank control group and the BLNK group （all P<0.05）.The expression of Bax in the BLNK group was obviously higher than that in the blank control group （P<0.05）， while the expression of Bax in the BLNK silence group was significantly lower than that in the blank control group and the Blank group （all P<0.05）. Conclusion Overexpression of BLNK could inhibit the expression of P53 and promote the proliferation and metastasis of breast cancer cells.

Graphical abstract

关键词

BLNK / P53 / 乳腺癌细胞 / 增殖 / 转移

Key words

BLNK / P53 / Breast cancer cell / Proliferation / Metastasis

乳腺癌是女性常见的癌症，其发病率和死亡率显著增加，大约有10%的乳腺癌是遗传因素引起的，和家族史有一定的关系^［1］。乳腺癌是一种分子水平较高的异质性疾病。随着分子生物学技术的不断发展，以乳腺癌基因表达特征为基础的分子分型逐渐成熟，并以此为基础研究乳腺癌治疗的靶点、异质性、预后评估和侵袭性^［2］。乳腺癌变是由于多种致癌因素共同作用的结果，该病的转移也是一个多步骤的、连续的、严密的过程，所以寻找有效的治疗靶点已成为现在任务的重中之重。B细胞连接蛋白（BLNK）是B细胞特异性的衔接蛋白，相关研究表明，BLNK在乳腺癌细胞中高表达，并能够促进乳腺癌细胞的增殖和转移^［3］。P53是一种抑癌基因，能够通过调控细胞的生长、凋亡等过程起着抑制肿瘤发展的作用^［4］。但关于BLNK通过调控P53对乳腺癌细胞增殖和转移的作用尚不清楚，所以本实验主要探究BLNK通过抑制P53对乳腺癌细胞增殖和转移作用的影响，为乳腺癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人乳腺癌细胞株（MCF⁃7）购买于ATCC，慢病毒BLNK过表达质粒由吉玛公司合成，RIPA裂解液购自北京全式金生物技术有限公司，SDS⁃PAGE凝胶购于英国Abcam公司，P53、Cleaved⁃caspase 9、Apaf⁃1、Bax抗体购自北京索莱宝科技有限公司，0.25%胰蛋白酶购自联科生物技术有限公司。

1.2 细胞培养

MCF⁃7放于RPMI⁃1640培养基中培养，添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素，放于37°C、5%的CO₂培养箱中培养，待细胞密度超过90%，采用0.25%的胰蛋白酶消化传代。

1.3 细胞转染和分组

MCF⁃7细胞分为空白组、BLNK组和BLNK沉默组，空白组MCF⁃7细胞不进行任何转染处理，构建pMAL⁃c5x⁃BLNK重组质粒和构建BLNK的基因沉默表达载体，使用Lipofectamine 2000转染试剂，根据说明书转染慢病毒BLNK过表达质粒和BLNK的基因沉默表达载体。1.4　CCK⁃8检测细胞增殖　采用CCK⁃8试剂盒检测MCF⁃7细胞的增殖情况，3组细胞以1×10⁵个/孔接种在96孔板中，分别在0、24、72、96 h填入CCK⁃8溶液到每个孔中，孵育1 h后，采用酶标仪测定450 nm的吸光度（OD）。

1.5 细胞划痕实验

将3组转染后的MCF⁃7细胞以5×10⁵个/孔接种于6孔板，每组3个复孔，待细胞铺满板底后，采用无菌黄色枪头在细胞单层产生划痕，PBS冲洗3次，加入无血清培养基继续培养，24 h后，使用Image J软件分析迁移距离。

1.6 Transwell实验

将3组转染后的MCF⁃7细胞以4×10⁴个的密度接种于Transwell迁移小室上室，然后加入200 μl含10%FBS的培养基细胞在37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养。将穿透细胞膜的细胞用100%甲醇固定，用0.1%结晶紫染色，用棉签取出无迁移性细胞。随机选取100倍低倍镜视野5个，观察并计数。

1.7 Western blotting检测

从3组转染后的MCF⁃7细胞中分离总蛋白，采用BCA蛋白试剂盒检测蛋白的浓度，电泳、转移到PVDF膜，脱脂乳封闭，加入P53（1∶300稀释）、Cleaved⁃caspase 9（1∶300稀释）、Apaf⁃1（1∶500稀释）和Bax（1∶100稀释）一抗GAPDH，4 ℃孵育过夜，随后在二级抗体中孵育30 min，采用增强化学发光检测系统观察P53、Cleaved⁃caspase 9、Apaf⁃1和Bax的蛋白水平。

1.8 统计学处理

采用SPSS 23.0软件进行数据处理分析，实验数据采用\overline{x}\pm s表示，行t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BLNK对乳腺癌细胞增殖的作用

CCK⁃8检测结果显示，BLNK组24、48、72、96 h的细胞增殖能力明显高于空白组（P均<0.05）；BLNK沉默组24、48、72、96 h的细胞增殖能力显著低于空白组和BLNK组（P均<0.05）。见图1。

2.2 BLNK对乳腺癌细胞转移的作用

细胞划痕实验结果显示，BLNK组、BLNK沉默组和空白组0 h的细胞划痕愈合能力差异无统计学意义（P>0.05），BLNK组24 h的细胞划痕愈合能力明显高于空白组（P<0.05），BLNK沉默组24 h的细胞划痕愈合能力低于空白组和BLNK组（P均<0.05）；TUNEL法实验结果显示，BLNK组的细胞迁移能力明显高于空白组（P<0.05），BLNK沉默组的细胞迁移能力显著低于空白组和BLNK组（P均<0.05）。见图2。

2.3 BLNK对P53及相关蛋白的表达作用

Western blotting检测结果表明，BLNK组的P53、Cleaved⁃caspase 9、Apaf⁃1、Bax蛋白的表达水平显著低于空白组（P<0.05），BLNK沉默组的P53、Cleaved⁃caspase 9、Apaf⁃1、Bax蛋白的表达水平明显高于空白组和BLNK组（P均<0.05）。见图3。

3 讨论

乳腺癌是严重威胁着女性健康的恶性肿瘤^［5］。乳腺癌的发病机制尚不完全清楚，但相关研究发现，有一定高危因素的女性容易患有乳腺癌，乳腺癌的高危因素包括年龄、肥胖、抑郁、维生素D缺乏、乳腺癌家族史以及乳腺癌相关的基因突变等^［6］。目前乳腺癌的主要治疗手段包括放化疗和辅助化疗以及全乳切除术等，早期或者良性的患者可以采取保乳手术减轻损伤，再经过切除以及辅助的放化疗，可以提高患者的生存率^［7］。但是中晚期乳腺癌患者术后复发的风险较大，且易远处转移，而且具有很大的侵袭性和明显的生物学特性，所以寻找新型靶向分子是近几年研究的热点。

BLNK是一个B细胞的特异性蛋白，主要表达在B细胞和巨噬细胞中，能够向其下游分子传递信号来参与B细胞受体的信号转导^［8］。相关研究表明，BLNK贯穿整个B细胞个体的发生过程，在B细胞的发育、成熟和功能的发挥中起着重要的作用^［9］。BLNK也会阻止非整倍体的产生，非整倍体是人类癌症的一个共同特点，然而人类基因的完整性由P53来维持，P53能修复人体50%的癌症，在肿瘤的相关疾病中起着关键的作用^［10］。相关研究表明，BLNK能够转录和激活细胞内源的P53基因，对DNA的损伤起修复作用^［11］。本研究结果显示，过表达BLNK对细胞增殖能力明显增加，细胞划痕愈合能力明显增强，细胞迁移能力也有所提高，P53、Cleaved⁃caspase 9、Apaf⁃1蛋白表达水平降低，Bax蛋白的表达水平升高。沉默BLNK对细胞增殖能力显著减弱，细胞划痕愈合能力明显减少，细胞迁移能力也有所降低，P53、Cleaved⁃caspase 9、Apaf⁃1蛋白表达水平升高，Bax蛋白的表达水平降低。所以一旦BLNK蛋白异常，会产生非整倍体从而诱发癌症的产生。

综上所述，过表达BLNK可以抑制P53的表达而促进乳腺癌细胞增殖和转移，抑制BLNK可以增强P53的表达而降低乳腺癌细胞增殖和转移，所以BLNK可能成为乳腺癌治疗的新靶点，但关于BLNK如何调控P53基因的转录表达尚不完全清晰，需要下一步深入研究。

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基金资助

广东省自然科学基金项目(2018A030310014)