火神山医院新冠肺炎预防经典方中12种主成分的含量测定

Determination of 12 main components in COVID⁃19 preventive prescription Hanshiyufei decoction developed by Huoshenshan Hospital

摘要

目的 采用超高效液相色谱串联质谱法（UHPLC⁃MS/MS）测定火神山医院新冠肺炎预防经典方中12种主成分（黄芪甲苷、升麻苷、木犀草苷、金丝桃苷、毛蕊异黄酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陈皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊异黄酮、白术内酯⁃Ⅲ）的含量。 方法 以利血平为内标，色谱柱为ZORBAX SB⁃C₁₈（2.1 mm×100 mm，3.5 μm，Agilent，USA），流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，流动相B为0.1%甲酸和10 mmol/L醋酸铵水溶液，梯度洗脱，流速0.3 ml/min，进样量5 μl，柱温40 ℃，运行时间7.2 min。根据药典2015版对建立的方法进行方法学验证，并对3批预防经典方中12种主成分的含量进行测定。 结果 预防经典方中12种主成分在各自浓度范围内线性关系良好（r²>0.98），重复性、稳定性、精密度、加样回收率等均符合检测要求。 结论 本法操作简单、可靠，适用于预防经典方中12种主成分的含量测定，为火神山医院新冠肺炎预防经典方的质量控制提供了科学依据。

Abstract

Objective To determine the 12 main components（AstragalosideⅣ， Prim⁃O⁃glucosylcimifugin， Cynaroside， Hyperoside， Calycosin7⁃O⁃glucoside， Sec⁃O⁃glucosylhamaudol， Ononin， Nobiletin， Tangeretin， Cimifugin， Calycosin， Atractylenolide Ⅲ） in the COVID⁃19 preventive decoction Hanshiyufei developed by the hospital by using ultra⁃high performance liquid chromatography⁃tandem mass spectrometry （UHPLC⁃MT/MS）. Methods With reserpine as the internal standard， ZORBAX SB⁃C18 （2.1 mm×100 mm， 3.5 μm， Agilent， USA） column was used. The mobile phase A consisted of 0.1% formic acid at a flow rate 0.3 ml/min. The injection volume was 5 μl， column temperature was 40 ℃ and run time was 7.2 min. Validation of the established method was performed in accordance with the Pharmacopoeia （2015 edition）， and the 12 active ingredients in 3 batches of the drug were determined. Results Within their respective concentration ranges， there was good linear relationship in the 12 active ingredients of the 3 batches of Hanshiyufei decoction（r²>0.98）. Repeatability， stability， accuracy as well as recovery rate all met detection requirements. Conclusion This method is simple， reliable and suitable for the determination of the 12 active ingredients in Hanshiyufei decoction. Therefore， it could provide good scientific evidence for the quality control of Hanshiyufeitang.

Graphical abstract

关键词

新冠肺炎 / 预防经典方 / UHPLC⁃MS/MS / 含量测定

Key words

COVID⁃19 / Hanshiyufei decoction / UHPLC⁃MS/MS / Content determinationn

新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎，COVID⁃19）是一种急性感染性肺炎，其病原体是一种先前未在人类中发现的新型冠状病毒，简称“新冠肺炎”。患者以发热、干咳、乏力为主要表现的急性传染病，人群普遍易传染^［1］。中医学认为“正气存内，邪不可干”，在常规预防的同时，早期进行中医药干预可避免疫疠之邪的侵入和传变，从而达到“未病先防，既病防变”的作用。疫情期间全国多个城市纷纷采用中药对患者进行治疗，并且效果显著^［2］。在火神山医院病区中医中药治疗率达100%，纯中医治疗率达75%^［3］。中医治疗采用辛温解表之法温散、透寒邪，通过芳香避秽化浊治疗湿邪，同时调理脾胃来针对寒湿疫。根据患者的体质、病情、当地气候特点等，辨证施治^［4］。新冠肺炎预防经典方为武汉火神山医院依据国家卫健委印发的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》所引进的4种肺炎诊疗中药汤剂处方之一，用于新型冠状病毒预防治疗。使用液相色谱⁃三重四极杆串联质谱（HPLC⁃MS/MS）技术进行分析，因其具有分离效果好、灵敏度高、抗干扰能力强、选择性好等优点^［5］。

火神山医院新冠肺炎预防经典方由黄芪、麸炒白术、防风、贯众、金银花、陈皮、佩兰等7味药材的主成分为指标，对其中12种主成分（黄芪甲苷、升麻苷、木犀草苷、金丝桃苷、毛蕊异黄酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陈皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊异黄酮、白术内酯⁃Ⅲ）进行含量测定，建立超高效液相色谱⁃串联质谱（ultra⁃high performance liquid chromatography⁃tandem mass spectrometry， UHPLC⁃MS/MS）法进行含量测定，为火神山医院新冠肺炎预防经典方的质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

安捷伦1200系列高效液相色谱仪（HPLC）由美国安捷伦科技公司制造（Agilent Technologies，美国），由G1311A型四元泵、G1322A型真空脱气机、G1329A型自动进样器和G1316A型柱温箱等组成。安捷伦6410A三重四极杆串联质谱仪由美国安捷伦科技公司制造（Agilent Technologies，美国），离子源为ESI型，数据采集及处理系统采用MassHunter软件。定时可调速旋涡混合器（美国labnet公司），Eppendorf 5418R型台式冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司），百万分之一电子天平，MES3.6P⁃0CE0DM型（赛多利斯，哥廷根，德国，最大称重3.1 g，分辨率0.001 mg）；单通道移液枪，Reaserch plus型，量程10、20、 100、200、1 000 μl（艾本德，汉堡，德国）。超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，SK7200H型）。旋涡混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，Vortex QL⁃901型），煎药壶（苏泊尔液体加热器，SW⁃30Y06），灌装针头式滤器（上海泰坦科技股份有限公司，聚醚砜PES，0.22 μm，13 mm）。

新冠肺炎预防经典方3批（黄芪15 g、麸炒白术9 g、防风9 g、贯众6 g、金银花9 g、陈皮6 g、佩兰9 g，上海长征医院中药房提供）。黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，批号：J25F10T81373）、毛蕊异黄酮苷（Calycosin7⁃O⁃glucoside，批号：Y13F11H108672）、毛蕊异黄酮（Calycosin，批号：Y24N9Y75652）、刺芒柄花苷（Ononin，批号：P03A10F84910）、白术内酯⁃Ⅲ（Atractylenolide Ⅲ，批号：M13D10S105676）、升麻苷（Prim⁃O⁃glucosylcimifugin，批号：Y31M9H62747）、亥茅酚苷（Sec⁃O⁃glucosylhamaudol，批号：Y02A7H18874）、升麻素（Cimifugin，批号：Y11O9H72162）、桔皮素（Tangeretin，批号：H24F11K108893），川陈皮素（Nobiletin，批号：N10J10R90249）、木犀草苷（Cynaroside，批号：Y13J10H93050），金丝桃苷（Hyperoside，批号：Y08N9X74602）、利血平（Reserpine，批号：Y02M11Y17235）对照品，均由上海源叶有限公司提供。质谱纯甲醇（Merck公司，德国），质谱纯乙腈（Merck公司，德国），色谱纯甲酸（天地公司，美国），蒸馏水（屈臣氏，中国）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB⁃C₁₈（2.1 mm×100 mm，3.5 μm，Agilent，USA）。流动相：A相0.1%甲酸乙腈溶液：B相0.1%甲酸和10 mmol/L醋酸铵水溶液。流速：0.3 ml/min。进样量：5 μl，柱温：40°C。运行时间：7.2 min。梯度洗脱条件见表1。

1.2.2 质谱检测条件

选用电喷雾（ESI）离子源，监测模式选择正离子模式分析，质谱喷雾针电压（Capillary）设置为4 000 V，离子源温度设置为350 ℃。雾化气及干燥气选用氮气（N₂），碰撞池所用气体为高纯氮气（N₂），设置压力为0.1 MPa；其他质谱参数优化结果如下：雾化气压力设置为40 psi；MS₁和MS₂的加热温度均为105 ℃；气体流速设置为10 ml/min，扫描方式为多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）。将一定浓度的对照品溶液和内标溶液进样，ESI电离方式下，进行产物离子全扫描分析，随后对单个分析物的F值和CE值进行优化，选择最优的F值和CE值后，确定其子离子。用于定量分析的参数见表2。

分别对黄芪甲苷、升麻苷、金丝桃苷、木犀草苷、毛蕊异黄酮苷 、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陈皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊异黄酮、白术内酯⁃Ⅲ和内标利血平母离子进行产物离子全扫描分析，并将以上碎片离子作为定量分析时监测的产物离子。见图1。

1.2.3 对照品溶液的制备

依次精密称取黄芪甲苷、升麻苷、毛蕊异黄酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陈皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊异黄酮、白术内酯⁃Ⅲ、利血平（内标）标准品2.02 mg、2.02 mg、2.02 mg、2.02 mg、2.06 mg、2.04 mg、2.01 mg、2.03 mg、2.02 mg、2.03 mg、2.06 mg，分别置于2 ml容量瓶中，以纯甲醇定容至刻度，摇匀，得储备液，分装后储存于-20 ℃的冰箱中。精密称取2.01 mg木犀草苷，置于2 ml容量瓶中，加入少量二氯甲烷溶解，然后用纯甲醇稀释至刻度，摇匀，得到对照品的储备液，分装后置于-20 ℃冰箱保存。精密称取2.03 mg金丝桃苷，置于2 ml容量瓶中，加入少量二甲基亚砜DMSO溶解，然后用纯甲醇稀释至刻度，摇匀，得到对照品的储备液，分装后置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 供试品溶液的制备

取预防经典方中黄芪15 g、麸炒白术9 g、防风9 g、贯众6 g、金银花9 g、陈皮6 g、佩兰9 g，置于容器中加入800 ml水浸泡30 min，再用煎药壶（苏泊尔液体加热器，SW．30Y06）煎煮100 min，冷却后倒出滤液混匀约300 ml，取1 ml滤液，加入10 μg/ml的利血平10 μl，涡旋混匀3 min，室温，13 500 r/min条件下离心10 min后取上清液，过0.22 μm微孔滤膜后，取续滤液进样分析。

1.3 方法学考察

1.3.1 专属性

专属性（specificity）指所建立的方法能从样本中准确选择待测化合物并同其余杂质区分的能力。取12种化合物适量，随后再用纯甲醇稀释，制得黄芪甲苷浓度为0.2 µg/ml、升麻苷浓度为2.0 µg/ml、木犀草苷浓度为0.2 µg/ml、金丝桃苷浓度为2.0 µg/ml、毛蕊异黄酮苷浓度为0.1 µg/ml、亥茅酚苷浓度为0.2 µg/ml、刺芒柄花苷浓度为0.1 µg/ml苷、川陈皮素浓度为0.2 µg/ml、桔皮素浓度为0.1 µg/ml、升麻素浓度为0.2 µg/ml、毛蕊异黄酮浓度为0.1 µg/ml、白术内酯⁃Ⅲ浓度为0.1 µg/ml的定量下限（LLOQ）浓度。同上制作利血平（内标）的标准品样本。取来自3份不同试剂瓶的甲醇和供试品样本，按照“1.2.4供试品溶液的制备”所述方法进行处理后进样分析。待测化合物及内标的响应不超过LLOQ样本响应的20%及内标响应的5%时即为合格。

1.3.2 精密度实验

取同一对照品溶液，根据“1.2.1”项下色谱条件进行测定，重复进样6次，并记录峰面积。相对峰面积的RSD%在15％以内，表明进样仪器的精密度良好。

1.3.3 重复性实验

取预防经典方一批，按照“1.2.4”项平行制备6份供试品溶液，测定在“1.2.1”项色谱条件下的相对保留时间和相对峰面积。相对保留面积RSD%在15%以内。表明该实验方法的重复性良好。

1.3.4 稳定性实验

取预防经典方一批，并根据“1.2.4”项下平行制备6份供试品溶液，在“1.2.1”项色谱条件下，分别记录0、2、4、8、24 h的相对保留时间和相对峰面积。相对保留面积RSD%在15％以内。表明供试样品溶液在24 h内稳定性好。

2 结果

2.1 方法学考察结果

2.1.1 专属性考察结果

取12种化合物适量，随后再用纯甲醇稀释，制得最低定量下限浓度样本，见图2。同上制作利血平（内标）的标准品样本，见图3。取来自3份不同试剂瓶的甲醇和供试品样本，按照“1.2.4供试品溶液的制备”所述方法进行处理后进样分析，见图4。待测化合物及内标的响应均不超过LLOQ样本响应的20%及内标响应的5%，专属性考察合格。

2.1.2 线性考察结果

按照“1.2.3”项下制备标准品溶液，得到混合对照品色谱图。将标准品储备液用纯甲醇稀释，黄芪甲苷、升麻素、木犀草苷、亥茅酚苷、川陈皮素浓度梯度为：0.2、0.5、1、2、5、8、10 μg/ml；毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花苷、桔皮素、毛蕊异黄酮、白术内酯⁃Ⅲ浓度梯度为：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 μg/ml；升麻苷、金丝桃苷浓度梯度为：2、4、6、8、10、20、50 μg/ml；在“1.2.1”项色谱条件下，分别记录12种有效成分的峰面积，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，结果见表3。

2.1.3 精密度实验结果

取同一对照品溶液，根据“1.2.1”项下色谱条件进行测定，重复进样6次，并记录峰面积。黄芪甲苷、升麻苷、金丝桃苷、木犀草苷、毛蕊异黄酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陈皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊异黄酮、白术内酯⁃Ⅲ的峰面积RSD%分别为3.72%、0.85%、2.16%、2.11%、1.62%、0.94%、1.11%、0.72%、0.89%、1.35%、1.13%、0.48%，均小于15%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性实验结果

取同一供试品溶液，并根据“1.2.1”项色谱条件在0、2、4、8、24 h测定。黄芪甲苷、升麻苷、金丝桃苷、木犀草苷、毛蕊异黄酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陈皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊异黄酮、白术内酯⁃Ⅲ的峰面积RSD%分别为5.73%、1.24%、5.72%、8.43%、2.84%、1.37%、3.03%、5.67%、6.91%、2.64%、5.33%、3.11%，均小于15%，表明供试品在24 h内稳定。

2.1.5 重复性实验结果

取同一供试品溶液，按照“1.2.4供试品溶液的制备”项下条件，平行制备6份样品，并根据“1.2.1”项色谱条件进行测定，黄芪甲苷、升麻苷、金丝桃苷、木犀草苷、毛蕊异黄酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陈皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊异黄酮、白术内酯⁃Ⅲ的峰面积RSD分别为3.53%、7.53%、5.97%、8.43%、4.73%、4.15%、3.75%、5.37%、3.85%、4.02%、8.17%、1.53%，均小于15%，表明系统重复性良好。

2.1.6 加样回收率

精密量取预防经典方溶液0.5 ml，加入各对照品适量，平行制备6份，按“1.2.4”项方法制备供试品溶液，并根据“1.2.1”项的色谱条件进行分析，计算各待测物的平均回收率，按照“回收率=（实测量－样品含量）/加入量×100%”公式计算加样回收率，黄芪甲苷、升麻苷、金丝桃苷、木犀草苷、毛蕊异黄酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陈皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊异黄酮、白术内酯⁃Ⅲ的平均加样回收率分别为107.57%、106.55%、100.59%、110.61%、106.68%、92.68%、112.46%、85.39%、109.46%、99.08%、101.47%、96.61%。

2.2 样品含量测定

取3批预防经典方药方，按“1.2.4供试品溶液的制备”项制备样本，按“1.2.1色谱条件”项色谱条件测定黄芪甲苷、升麻苷、金丝桃苷、木犀草苷、毛蕊异黄酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陈皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊异黄酮、白术内酯⁃Ⅲ的含量，测定结果见表4。

3 讨论

3.1 供试品溶液的制备

火神山医院新冠肺炎预防经典方由黄芪、麸炒白术、防风、贯众、金银花、陈皮、佩兰等7味中药组方而成，黄芪具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌之功效，近年研究表明，黄芪主要含黄芪多糖、黄芪皂苷和黄酮类成分，具有增强免疫系统功能、抗心肌缺血、双向调节血压、保护血管内皮细胞、保肝、抗肿瘤、清除自由基和抗衰老等作用^［6］。白术的干燥根茎，具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎之效^［7］。主治脾虚食少、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安等症^［8］。近年来的研究表明白术具有利尿、抗菌、抗衰老、抗肿瘤等作用，对神经系统、子宫平滑肌、肠胃运动也有一定作用，还能调节免疫功能^［9］。防风主要具有解热、镇痛、镇静、抗炎、抗菌、抗肿瘤、提高机体免疫功能、抗过敏、抗凝血等药理作用^［10］。贯众具有清热解毒、驱虫、凉血、止血等作用。临床上用于治疗风热感冒，湿热癍疹、吐血、便血及崩漏等疾病^［11］。金银花具有抗炎、解热、抗菌、抗病毒、保肝利胆、抗氧化、抗血小板聚集、抗肿瘤、增强免疫力等作用，临床应用时应结合具体病情，选用适宜的配伍方案，以取得最佳的治疗效果^［12］。陈皮味苦、辛，性温，归肺、脾经。具理气健脾、燥湿化痰之功^［13］。佩兰用于湿浊中阻，脘痞呕恶，口中甜腻，口臭，多涎，暑湿表证，湿温初起，发热倦怠，胸闷不舒^［14］。中药中主成分对治疗新冠肺炎起着重要的作用，中药的煎煮对实验的成功起着重要的作用。将中药置于容器中加入800 ml水浸泡30 min，再用冷却的煎药壶煎煮100 min，待药液冷却后倒出滤液混匀约300 ml，煎药过程中严格把控加入水量、浸泡时间、煎煮时间。

3.2 内标的选择

在预实验中分别考察了苯甲酸、卡马西平、利血平3个标准品作为内标，根据3个内标的响应和出峰时间，最终选用了出峰时间居中、响应好、稳定性高的利血平作为内标。

3.3 色谱柱的选择

使用乙腈⁃0.1%甲酸水溶液（60∶40）作为流动相，分别选用ZORBAX SB⁃C₁₈（2.1 mm×50 mm，3.5 μm，Agilent，USA），显示化合物出峰过早，该柱对化合物的保留效果较差。Xbridge®HILIC（2.1 mm×100 mm 3.5 μm，Waters，USA），显示化合物出峰较晚，该柱对化合物的保留时常较长，不宜选用。ZORBAX SB⁃C₁₈（2.1 mm×150 mm 3.5 μm，Agilent，USA），显示化合物出峰较晚，该柱对化合物的保留较长，不宜选用。ZORBAX SB⁃C₁₈（2.1 mm×100 mm 3.5 μm，Agilent，USA），显示化合物出峰时间适宜，符合选用标准。

3.4 流动相的选择

实验考察了乙腈⁃0.1%甲酸水溶液作为流动相，结果显示峰形有拖尾现象，增加水相中的甲酸浓度至0.2%的流动相，酸性的增强抑制了酸性化合物的电离，保留时间增加，酸性化合物出现拖尾，而碱性化合物拖尾改善，但有峰裂分现象，随后选用0.1%甲酸⁃10 mmol/L醋酸铵水溶液⁃乙腈，所有化合物的峰形均有改善，碱性化合物略有拖尾现象，峰形无裂分，进一步优化流动相为0.1%甲酸⁃10 mmol/L醋酸铵水溶液⁃0.1%甲酸乙腈，结果显示所有化合物峰形较好，无拖尾、峰裂分现象。

4 结论

实验建立了一种快速、灵敏、稳定的UHPLC⁃MS/MS方法，方法学验证结果表明专属性、线性、重复性、稳定性、精密度、加样回收率结果均符合要求。本法操作简单、可靠，适用于测定新冠肺炎预防药方寒湿郁肺汤中12种主成分的含量测定，为火神山医院新冠肺炎预防经典方的质量控制提供科学依据。

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