玉米与毛叶苕子及黑麦间作对土壤有机碳及其组分的影响

Effects of Maize Intercropping with Hairy Vetch and Rye on Soil Organic Carbon and Its Fractions

摘要

目的 探究玉米（Zea mays L.）与不同科属绿肥（也称覆盖作物）间作对土壤耕层和亚耕层有机碳组分的影响，明确间作体系中微生物残体碳在土壤固碳中的贡献，为绿肥种植促进农田土壤固碳和地力提升提供理论支撑。 方法 田间设置玉米单作（MM）、玉米间作豆科绿肥毛叶苕子（Vicia villosa Roth.）（LM）、玉米间作禾本科绿肥黑麦（Secale cereale L.）（PM）3个处理，测定0~20、20~40 cm土壤有机碳（SOC）、SOC组分（颗粒态有机碳POC和矿物结合态有机碳MAOC）、微生物残体碳及土壤理化性质。 结果 在0~20 cm耕层土壤中，3个处理之间SOC质量分数无显著差异；而在20~40 cm亚耕层土壤中，与玉米单作相比，间作豆科绿肥和禾本科绿肥处理SOC质量分数分别明显增加35.0%和29.1%，全氮质量分数分别增加19.2%和28.8%。间作绿肥显著提升β-1，4-葡萄糖苷酶活性，LM和PM处理亚耕层微生物残体碳质量分数分别增加38.1%和34.1%，且亚耕层SOC与微生物残体碳呈显著线性正相关。表土层中，豆科绿肥处理土壤POC质量分数显著增加45.4%，亚耕层中，间作禾本科绿肥处理土壤MAOC质量分数提升27.8%。 结论 间作绿肥后，表土层绿肥植物残体分解生成POC，通过增加POC维持耕层土壤有机碳质量分数，而亚耕层土壤中微生物碳泵的周转促进FNC积累进而增加SOC。豆科绿肥通过增加POC和MAOC积累促进亚耕层土壤有机碳固存，禾本科绿肥主要促进MAOC积累增加亚耕层土壤有机碳。研究结果为黑土区地力提升与保育提供理论与技术支撑。

Abstract

Objective To investigate how maize （Zea mays L.） intercropped with green manure （cover crops） from different plant families affects soil organic carbon （SOC） fractions in the topsoil （0-20 cm） and subsoil （20-40 cm） layers， quantify the contribution of microbial necromass carbon （MNC） to SOC sequestration in such intercropping systems， and provide a theoretical basis for improving SOC sequestration and soil fertility through green manure cultivation. Methods A field experiment was established with three treatments： maize monoculture （MM）， maize intercropped with leguminous green manure hairy vetch （Vicia villosa Roth.， LM）， and maize intercropped with graminaceous green manure rye （Secale cereale L.， PM）. Soil organic carbon， SOC fractions （particulate organic carbon， POC， and mineral-associated organic carbon， MAOC）， MNC， and key soil biochemical properties were measured at 0-20 cm and 20-40 cm depths. Results In the 0-20 cm topsoil， SOC mass fractions did not differ significantly among treatments. Compared to the MM control， SOC mass fractions under the LM and PM increased by 35.0% and 29.1% in the 20-40 cm layer， respectively. Total nitrogen content increased significantly by 19.2% and 28.8%， respectively. Intercropping significantly enhanced β-1，4-glucosidase activity. Compared to the control， MNC in the subsoil rose by 38.1% under LM and by 34.1% under PM， and SOC was strongly and significantly correlated with MNC. In the topsoil layer， POC content under LM increased by 45.4% compared to the MM control， whereas in the subsoil layer MAOC content under PM increased by 27.8%. Conclusion Intercropping with green manure sustains SOC in the topsoil layer by generating POC from decomposing plant residues， While in the subsoil layer the ″microbial carbon pump″ enhances MNC accumulation， thereby increasing SOC. Leguminous green manure promotes SOC sequestration in the subsoil layer by raising both POC and MAOC， whereas graminaceous green manure acts mainly through MAOC accumulation. These findings provide theoretical and technical support for fertility improvement and conservation of black-soil regions..

Graphical abstract

关键词

绿肥 / 土壤有机碳 / 亚耕层 / 黑土区

Key words

green manure / soil organic carbon / subsoil / black soil

土壤有机碳是全球碳循环的巨大碳库，据统计^［1-2］，农田土壤每年可固存0.90~1.85 Pg C，加强农田土壤有机碳固存对于缓解气候变化和提升土壤质量及作物生产力具有重要意义。东北地区是我国重要的粮食主产区，黑土面积超过109万hm²，但由于长期单一集约化种植以及浅耕、化肥农药过量使用、有机资源还田不足等原因，再加上风蚀和水蚀等自然因素的共同作用，使黑土“变薄”“变瘦”与“变硬”等问题突出^［3］。提升耕层和亚耕层有机碳积累是遏制黑土退化趋势的关键。绿肥（覆盖作物）作为一种天然的有机肥源，能够从内源驱动土壤碳氮循环并改善土壤结构，是固碳培肥、地力提升和作物增产的重要措施^［4-5］。

种植绿肥覆盖作物能将土壤有机碳提高12%，并且颗粒态有机碳（POC）和矿物结合态有机碳（MAOC）组分分别增加15%和7%。土壤POC主要来源于植物残体的分解，相对容易被微生物分解利用^［6］。MAOC由植物源碳或微生物分解产生的可溶性有机碳（DOC）直接吸附到矿物表面形成，或DOC经过微生物同化、死亡后形成的胞外化合物和微生物残体与矿物结合形成，受土壤团聚体保护不易被微生物降解，在土壤中较为稳定^［7］。在农田土壤中，经土壤微生物体内周转形成的微生物残体对SOC的贡献达到51%^［8］。绿肥还田或死亡后能够增加土壤中碳的输入，经微生物吸收同化促进微生物残体积累，同时，绿肥根系可改善土壤团聚过程，有利于土壤碳受到物理化学保护，促进土壤碳的固存和稳定^［4］。有研究^［9］发现，绿肥的固碳效应受土层影响，绿肥种植可显著提升0~10、10~20 cm的SOC及其组分含量，随土层深度增加增碳效果减弱。然而，种植绿肥对黑土区耕层和亚耕层SOC及组分积累的影响与机制尚不清楚。

不同科属绿肥作物的根系形态、残体质量、生物量和养分含量存在较大差异，还田后土壤固碳效应悬殊^［4］。豆科绿肥具有固氮功能，能提供丰富的氮素，其残体碳氮比低，禾本科绿肥较豆科生物量大^［10］，残体碳氮比高。因此，绿肥作物种类可能通过调节微生物群落结构和代谢过程而影响土壤碳库组成和固碳能力^［5］。有研究^［11］表明，豆科绿肥通过显著增加POC和MAOC质量分数，将SOC提升38%，且固碳效应较非豆科绿肥提升16%，更有利于土壤SOC固持；也有研究^［12］发现，绿肥作物的生物量或碳输入总量是SOC积累的主导因素，而非绿肥残体质量。可见，不同种类绿肥作物的固碳效应存在争议，可能与绿肥作物自身特性（碳氮比、生物量与养分积累、根系特性）、土壤条件（质地、类型、结构、酸碱度、水分、温度）、气候条件和管理措施（种植方式、翻压时间、施肥与耕作）等因素有关^［9］。但黑土区种植不同科属绿肥作物的固碳效果差异尚不明确。因此，本研究通过田间定位试验，探究玉米单作、玉米间作豆科绿肥毛叶苕子、玉米间作禾本科绿肥黑麦等模式下，间作不同科属绿肥对耕层和亚耕层SOC积累及其组分的影响及原因，以期为东北黑土区合理利用绿肥固碳培肥与耕地保育提供理论依据与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

田间试验设在中国科学院沈阳应用生态研究所昌图现代农业试验站保护性耕作基地进行，位于辽宁省昌图县亮中桥镇（42.74°N，123.86°E）。该区属温带大陆性季风气候，年平均气温8.9 ℃，年平均降水量602 mm，供试土壤类型为棕壤土。定位试验始于2022年4月，耕层（0~20 cm）土壤砂粒、粉粒和黏粒质量分数分别为35.1%、46.7%和18.2%，根据美国农业部土壤分类标准，土壤质地为粉质黏壤土。初始土壤理化性质为pH 5.32，有机碳12.04 g/kg，全氮1.20 g/kg，全磷0.46 g/kg，全钾19.20 g/kg^［13］。

1.2 试验设计及田间管理

试验设3个处理，玉米（Zea mays L.）单作（MM）、豆科绿肥毛叶苕子（Vicia villosa Roth.）-玉米间作（LM）和禾本科绿肥黑麦（Secale cereale L.）-玉米间作（PM），随机区组设计，重复4次。供试玉米品种为“东单1331D”，黑麦品种为“冬牧70”，毛叶苕子为普通品种。小区面积为126 m²（15.0 m×8.4 m），玉米采用宽窄行种植（50 cm+90 cm），其中，间作体系在玉米宽行种植3行绿肥，窄行种植2行玉米，每年玉米与绿肥进行倒茬。每年于5月上旬同时播种玉米和绿肥（2024年播期为5月8日），玉米播种密度为67 500株/hm²，所有小区基肥施入等量复合肥（26-10-12）900 kg/hm²，无追肥；毛叶苕子和黑麦播种密度分别为120、90 kg/hm²，不额外施肥，绿肥一般于9月自然死亡，并于10月收获玉米（2024年收获于10月13日）。整个生育期内雨养、无灌溉，玉米种植带采用化学药剂除草，绿肥种植带进行人工除草，其他管理措施与当地常规一致。

1.3 样品采集与测定

本研究于2024年10月9日玉米成熟期采集0~20、20~40 cm土壤样品，在各小区玉米窄行采集3个土壤，混合成1个土壤样品。去除砾石、根系等杂质，过2 mm筛，分成2份，其中1份置于冰盒带回实验室保存于-20 ℃，用于测定土壤铵态氮（NH₄⁺-N）、硝态氮（NO₃^--N）、可溶性有机碳（DOC）、可溶性有机氮（DON）、微生物生物量碳（MBC）、微生物生物量氮（MBN）和酶活性；另外1份自然风干，用于测定土壤有机碳（SOC）、全氮（TN）、颗粒态有机碳（POC）、矿物结合态有机碳（MAOC）和氨基糖。

1）土壤基础理化性质：土壤pH采用电位法（水土比为2.5∶1）测定；土壤有机碳（SOC）和全氮（TN）采用元素分析仪（Elementar vario PYRO cube，德国）测定。新鲜土样用2M KCl溶液浸提（水土比为5∶1），使用全自动间断化学分析仪（Smartchen 450，AMS，意大利）测定土壤NH₄⁺-N和NO₃^--N质量分数，并采用烘干法测定土壤水分体积分数。新鲜土样用超纯水进行浸提后过0.45 μm滤膜^［14］，使用总有机碳分析仪（Elementar vario TOC，德国）测定可溶性有机碳（DOC）和可溶性总氮，通过可溶性总氮和无机氮的差值得到可溶性有机氮（DON）；土壤微生物生物量碳（MBC）和微生物生物量氮（MBN）采用氯仿熏蒸-K₂SO₄浸提^［15］，并使用总有机碳分析仪测定碳氮质量分数。

2）有机碳组分：土样经六偏磷酸钠溶液分散后，53 μm孔径筛分，获得POC（>53 μm）和MAOC（≤53 μm）组分，并采用重铬酸钾-硫酸氧化法测定各组分有机碳质量分数。

3）土壤酶活性：采用96孔微孔板荧光法，使用全功能微孔板检测仪（SynergyH1 microplate reader，BioTek，美国）测定土壤酶活性，包括β-1，4-葡萄糖苷酶（BG）、纤维二糖水解酶（CB）、β-木糖苷酶（BX）、β-1，4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）和磷酸酶（PA）。

4）氨基糖含量：将0.5 g土样在6M HCl中水解8 h，得到水解物过滤、中和并纯化以分离有机部分，通过液相色谱分析得到4种氨基糖含量^［16］，包括胞壁酸（MurA）、氨基葡萄糖（GluN）、氨基半乳糖（GalN）和甘露糖胺（ManN），细菌残体碳（BNC）、真菌残体碳（FNC）和微生物残体碳（MNC）含量计算公式^［17］见公式（1）~公式（3），通过微生物残体碳与微生物量碳的比值计算得到微生物残体质量积累系数（NAC）。

BNC=MurA×31.3（1）

FNC=（GluN-1.16×MurA）×10.8（2）

MNC=BNC+FNC（3）

NAC=MNC/MBC（4）

1.4 统计分析

采用R软件（4.4.1）中的“Agricolae”包进行方差分析，采用LSD方法在p<0.05的水平上进行多重比较，并使用Benjamini–Hochberg法校正p值。使用Graphdpad Prism 9.5软件进行作图，使用Origin 2025软件对SOC与碳组分及微生物残体碳等指标进行皮尔逊相关分析，使用R的“linkET”包进行Mantel检验，分析环境因素对SOC及其组分间的相关性。使用R的“plspm”包进行土壤性质与有机碳组分间的偏最小二乘路径分析（PLS-PM）。

2 结果与分析

2.1 间作绿肥对土壤化学性质的影响

由表1可知，玉米间作绿肥对土壤化学性质有显著影响。与单作MM相比，间作绿肥处理0~20、20~40 cm土层pH降低5.2%~6.7%；LM和PM处理20~40 cm土壤的全氮质量分数分别增加19.2%和28.8%。间作绿肥后土壤SOC/TN无显著变化。

不同处理间各土层DOC质量分数无显著差异，但与LM相比，PM处理0~20 cm土层DON质量分数降低7.0%，DOC/DON比值增加37.9%。与MM相比，PM处理对2个土层MBC质量分数无显著影响，但LM处理耕层土壤MBC质量分数降低53.4%，亚耕层中增加85.2%；间作绿肥处理2个土层MBN质量分数平均降低34.8%。与MM对照相比，LM处理对土壤无机氮质量分数无显著影响，PM处理耕层土壤无机氮降低37.6%，亚耕层增加26.2%。

2.2 间作绿肥对土壤有机碳及碳组分的影响

由图1可知，在0~20 cm土层，不同处理之间SOC和MAOC质量分数均无显著差异，但LM较MM处理POC质量分数增加45.4%。与MM相比，LM和PM处理20~40 cm土层SOC质量分数分别显著增加35.0%和29.1%；间作绿肥处理POC质量分数呈增加趋势；PM较MM处理亚耕层土壤MAOC质量分数显著提升27.8%。间作绿肥后，0~20 cm土壤MAOC与POC的比值平均降低29.1%，亚耕层平均降低27.5%；各处理间POC和MAOC组分对SOC的贡献无显著差异，但与耕层土壤相比，亚耕层POC的贡献平均降低58.1%，MAOC的贡献降低25.7%。

2.3 间作绿肥对土壤酶活性及微生物残体碳积累的影响

由图2可知，对于微生物碳获取酶，间作毛叶苕子和黑麦土壤BG酶活性无显著差异，但二者在0~20、20~40 cm土层较MM对照分别平均提高46.3%和51.0%。间作绿肥处理较MM处理0~20 cm土层CB酶活性平均增加56.8%，20~40 cm土壤CB和BX活性呈增加趋势，但不显著。对于微生物氮获取酶，耕层土壤中PM较LM处理的LAP活性降低49.1%，亚耕层土壤中无显著差异；间作绿肥处理的NAG活性呈增加趋势，但与MM无显著差异。间作绿肥对土壤磷获取相关酶活性无显著影响。

由图3可知，在0~20 cm土层，仅LM处理总微生物残体碳和总氨基糖质量分数显著增加，但在20~40 cm土层，LM和PM处理较MM对照的真菌残体碳质量分数分别显著提升37.4%和33.0%，细菌残体碳质量分数分别增加41.7%和40.2%。与MM处理相比，LM和PM处理20~40 cm土壤氨基甘露糖、氨基半乳糖、氨基葡萄糖和总氨基糖质量分数显著增加31.2%~47.5%。

总体上，真菌残体碳在微生物残体碳中占比较大，是细菌残体碳的4.69~5.62倍。耕层土壤中LM残体碳质量积累系数呈增加趋势，亚耕层土壤中趋势相反。

2.4 土壤有机碳及碳组分与土壤生物化学性质的相关性分析

由图4可知，MM和LM处理的SOC质量分数与POC和MAOC质量分数呈显著正相关；对于PM处理，SOC质量分数与POC无明显相关性，但与MAOC质量分数呈显著正相关。0~20、20~40 cm土层，SOC与微生物残体碳、细菌残体碳、真菌残体碳质量分数及氨基糖总量呈显著正相关，但20~40 cm土层中决定系数（R²=0.82~0.84）大于0~20 cm土层（R²=0.35~0.72）。

由图5可知，耕层与亚耕层SOC及组分受土壤理化性质的影响存在较大差异。耕层土壤POC与BG酶活性、FNC、MNC、DON、MBC和NAC相关，SOC与土壤TN、BG、NAG、PA酶活性、FNC、BNC、MNC相关；亚耕层土壤中，POC主要受TN、Nmin、LAP、MBN和NAC影响，SOC与土壤TN、SOC/TN比、BNC、FNC、MNC、MBN以及BG酶活性相关。

由图6可知，在玉米单作中，土壤可溶性有机碳对POC有显著正向影响（路径系数为0.877^*）。在玉米间作豆科绿肥方式下，土壤可溶性有机碳氮对土壤碳获取酶活性有显著正向影响（路径系数为0.834^*），并对POC和MAOC有显著正向效应（路径系数为0.769^*和0.858^*）。对于玉米间作禾本科绿肥种植系统，土壤可溶性有机碳氮对MAOC具有直接正向作用（路径系数为0.841^**），碳获取酶活性对MAOC具有正向影响（路径系数为0.692^*）。

3 讨 论

亚耕层土壤固碳是促进长期碳库稳定的重要途径^［18］，绿肥通过物理、化学和生物机制协同促进土壤有机碳的固存^［4］。长期间作绿肥不仅能提升耕层有机碳含量，而且可通过增加地下碳输入和改善微生物活动增加底土的碳储量^［19］。本研究条件下，与玉米单作相比，玉米间作豆科和禾本科绿肥显著提高20~40 cm亚耕层土壤有机碳和全氮质量分数（表1和图1），可能与间作豆科绿肥提高20~40 cm大团聚体中SOC和TN质量分数有关^［20］。虽然间作绿肥处理增加耕层碳源输入，但有机碳增加并不显著，可能与耕层土壤碳获取酶（如β-葡萄糖苷酶）活性较高及微生物矿化有关。有研究^［21］表明，添加外源碳后耕层土壤有机碳矿化损失量大于底层土壤；间作绿肥处理耕层MAOC呈下降趋势，且MAOC/POC比值显著降低（图1），表明新鲜碳输入所触发的SOC周转在表层土壤中可能比在底层土壤中更快。

土壤微生物残体碳对有机碳的贡献达55.6%~61.8%^［16］。与玉米单作相比，豆科绿肥处理增加亚土层的总氨基糖，间作绿肥后亚表土层的BNC和FNC均显著增加（图3）。亚表土层中，土壤有机碳与微生物残体碳、细菌残体碳及真菌残体碳呈显著正相关（图4）。可见，间作绿肥后通过促进微生物残体碳的积累增加亚表土层的有机碳^［22］。绿肥碳源的输入促进微生物碳泵的周转，玉米间作绿肥后增加土壤碳获取相关酶的活性（图2），微生物分解植物残体并吸收同化，一部分用于呼吸作用，一部分用于生物合成，在微生物衰亡后释放到土壤中形成微生物残体^［23］。细菌主要利用易分解的简单化合物，代谢周转速度快，真菌可利用复杂的化合物，且真菌也能有效地与细菌竞争易分解的碳源^［24］。真菌残体碳含有黑色素和几丁质，具有较高的化学稳定性，不易被分解^［25］，促进亚耕层有机碳积累。

与玉米单作相比，豆科绿肥处理中耕层土壤MBC下降，间作豆科和禾本科绿肥处理的MBN均降低（表1），与相关研究^［26］结果存在差异，可能是因为微生物量碳氮是土壤中活跃的碳组分，对环境变化较敏感，受到绿肥分解阶段和环境因素的影响。本研究在绿肥死亡还田后40 d取样，已有研究^［27］表明，绿肥还田40 d左右，其残体以较难分解利用的纤维素及木质素等组分为主，可能限制r-型策略微生物生长而导致微生物量碳氮降低^［28］。新鲜绿肥残体还田主要集中在耕层土壤，容易引起激发效应，一般外源有机碳的输入会使土壤原有有机质的矿化速率平均提高26.5%^［29］。间作绿肥后NAC呈现增加趋势，促进MBC向残体碳转化的速度，而PM处理耕层残体碳增加并不显著，可能因为绿肥的投入加快残体碳的矿化。间作绿肥后，土壤碳获取酶活性增强（图2），且耕层土壤POC与BG酶活性存在显著相关性（图5），促进绿肥植物残体分解形成POC组分。而间作绿肥后耕层土壤有机碳含量提升并不显著，MAOC与POC的比值下降（图1），表明有机碳的稳定性下降，可能是由于受到耕作措施的影响，且存在激发效应，矿化损失部分土壤原有有机质和固定的有机碳。豆科绿肥处理显著提高POC，线性分析中POC与SOC呈显著正相关（图4），进而维持耕层土壤有机碳。综上所述，间作绿肥后通过促进POC组分的形成维持耕层土壤有机碳累积，亚耕层土壤有机碳积累主要是由微生物残体碳的积累所介导。

不同科属绿肥在其自身生物量、根系特征、植株养分含量、碳氮比和还田后残体腐解程度等方面存在较大区别^［4］，造成固碳效应差异^［11］。不同科属绿肥根分泌物总量和组成各异，从而会招募形成不同的微生物群落^［5］。研究^［13］发现，豆科绿肥相比禾本科绿肥更有利于改善微生物群落结构。本研究条件下间作豆科绿肥处理中耕层和亚耕层土壤有机碳含量均最高。间作豆科绿肥模式下，土壤可溶性有机碳氮对土壤POC和MAOC有显著正向影响（图6）。耕层土壤中，豆科处理增加POC质量分数，高质量（低C∶N）植物残体的输入为微生物提供更多氮源，促进微生物分解植物残体形成POC^［30］。禾本科具有更大的根系生物量，可促进土壤团聚体的形成，有利于对土壤碳形成物理保护^［4］，能够解释亚耕土层禾本科处理中MAOC的增加，而豆科处理中土壤碳可能存在矿化分解，MAOC质量分数提升不显著。豆科处理中土壤POC、MAOC与SOC呈显著正相关，对于禾本科处理，SOC与MAOC呈显著正相关（图4）。有研究^［11］发现，豆科绿肥通过增加POC和MAOC进土壤有机碳质量分数提高，表明豆科处理中亚表土层有机碳的增加与POC和MAOC组分相关，而禾本科处理中MAOC的增加主导有机碳的固存。

受区域气候条件等因素限制，东北地区绿肥应用仍面临多重约束。本研究虽初步阐明玉米与豆科和禾本科绿肥间作对土壤耕层及亚耕层有机碳组分的影响，并明确微生物残体碳对土壤固碳的贡献，但关于绿肥内源驱动黑土地力的机理、绿肥应用下的微生物碳泵机制、绿肥种植技术模式等研究仍然不足。后续可对间作绿肥体系耕层和亚耕层绿肥残体碳转化与固定过程、微生物生活史策略转换、矿物结合态有机碳库的形成等方面开展系统研究，从绿肥视角为黑土区土壤固碳和地力提升提供新的理论依据。

4 结 论

1）与玉米单作体系相比，玉米间作豆科绿肥和禾本科绿肥对耕层土壤有机碳影响不大，但二者通过增加微生物残体碳积累促进亚耕层土壤有机碳固存，较单作体系分别增加35%和29%。

2）豆科绿肥通过增加POC和MAOC积累来促进亚耕层土壤有机碳固存，禾本科绿肥则主要通过促进MAOC积累来实现。

综合而言，间作绿肥有利于促进亚耕层土壤固碳，为东北黑土区有机质提升和耕地保育提供技术支撑。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2023YFD1501400)

国家自然科学基金项目(32202616)

国家绿肥产业技术体系项目(CARS-22)

中国农业科学院科技创新工程项目(CAAS-ASTIP-2021-OCRI)