蒙古马eca-miR-499-5p过表达和干扰慢病毒载体的构建、表达与鉴定

摘要

在基因调控的复杂网络中，microRNA(miRNA)作为关键的调控分子，影响着基因表达模式及细胞功能的多样性。其中，eca-miR-499-5p作为一个特定的miRNA，为快肌与慢肌纤维类型转换中的核心差异表达基因，通过与快肌标志性基因SOX6、MYOM2的靶向互作，在肌肉纤维类型调控中扮演重要角色。本研究旨在构建并鉴定蒙古马eca-miR-499-5p的过表达与干扰慢病毒载体系统。首先，设计并合成了分别用于过表达与干扰eca-miR-499-5p的质粒载体，利用293T细胞作为包装工具，成功制备了相应的慢病毒颗粒，并测定了病毒滴度以确保后续实验的可行性。为进一步验证载体的有效性，我们分离并培养了蒙古马的原代成肌细胞，通过免疫荧光进行细胞鉴定确保细胞纯度后，将构建的慢病毒载体导入至蒙古马成肌细胞中。然后，采用嘌呤霉素筛选，成功构建了eca-miR-499-5p稳定过表达与干扰的成肌细胞株。利用实时荧光定量PCR技术（RT-PCR），对处理后的细胞进行了eca-miR-499-5p表达水平分析，结果显示所构建载体在蒙古马成肌细胞中实现了eca-miR-499-5p的有效过表达与干扰。综上所述，本研究成功构建了针对蒙古马eca-miR-499-5p的过表达与干扰慢病毒载体，并通过试验验证了其有效性，为后续深入探讨eca-miR-499-5p在蒙古马肌肉发育、纤维类型转换中的作用机制奠定了坚实的实验基础与理论框架。

关键词

eca-miR-499-5p / 过表达技术 / 干扰技术 / 慢病毒载体构建

基金资助

国家自然科学地区联合基金项目（U23A20224）; 内蒙古自治区科学技术厅自治区科技重大专项项目（2020ZD0004）;内蒙古自治区科学技术厅自治区科技重大专项项目（2021ZD0018）; 农牧业厅种业专项项目（RK2300003651）; (2022年财政资金)高校基本科研业务费项目（BR22-11-03）; 内蒙古农业大学优秀青年科学基金培育项目（BR230405）; 内蒙古自治区教育厅一流学科科研专项项目（YLXKZX-NND-007）