不同体型双峰驼血浆外泌体的分离及其蛋白质组学分析

Screening for Differentially Expressed Proteins in Plasma Exosomes of Bactrian Camel with Different Body Types

摘要

为探究两种不同体型的双峰驼血浆外泌体在蛋白质表达方面的差异，本研究采用超速离心法分离双峰驼血浆外泌体，并利用透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）对分离的外泌体进行形态学观察与鉴定。基于蛋白质组学技术，研究对消瘦体型与正常体型双峰驼的血浆外泌体进行了差异表达蛋白（DEPs）的筛选，并对DEPs进行GO功能注释、KEGG信号通路富集及亚细胞定位等生物信息学分析。结果显示，超速离心法分离的双峰驼血浆外泌体呈杯状或圆形形态，直径约为100 nm，总体尺寸分布范围为30~150 nm。利用串联质谱标签（TMT）结合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术共标记了4 903个肽段，筛选出172个DEPs。生物信息学分析结果表明，这些DEPs可能与脂质代谢相关的信号通路相关，并存在蛋白之间互作关系。本研究结果为进一步探讨双峰驼血浆外泌体的生物功能提供了新的方向和重要资料。

Abstract

In order to investigate the differences in the protein expression of plasma exosomes from two different body types of bactrian camels， this study used the ultracentrifugation method to isolate plasma exosomes from bactrian camels， transmission electron microscopy （TEM） and nanoparticle tracking analysis （NTA） were used to observe and characterize the morphology of the isolated exosomes. Based on the proteomics technology， plasma exosomes from wasting body type and normal body type bactrian camel were screened for differentially expressed proteins （DEPs）， and bioinformatics analyses such as the GO functional annotation， KEGG signaling pathway enrichment analysis， and subcellular localization were performed on the DEPs. The results showed that the bactrian camel plasma exosomes isolated by ultracentrifugation had a cup-shaped or rounded morphology， with a diameter of about 100 nm and an overall size distribution ranging from 30 to 150 nm. A total of 4 903 peptides were labeled using the tandem mass spectrometry tagging （TMT） combined with the liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）， and 172 DEPs were screened out. Bioinformatics analysis showed that these DEPs may be associated with signaling pathways related to lipid metabolism and protein interactions. The results of this study provided a new direction and important information to further explore the biological functions of plasma exosomes in bactrian camel.

Graphical abstract

关键词

双峰驼 / 血浆外泌体 / 蛋白组学分析 / 生物信息学分析

Key words

Bactrian camel / Plasma exosomes / Proteomic analysis / Bioinformatics analysis

双峰驼在我国主要分布于西北地区，作为重要的运输工具被人类驯养。它们不仅为沙漠生态系统带来了活力，还为人类提供驼绒、驼肉、驼奶等资源^［1］。骆驼凭借其独特的生存能力，能够适应水源稀缺的环境，已有研究通过转录组学和蛋白质组学揭示了其在生理变化之外的独特适应性^［2-3］。骆驼的蛋白质编码基因参与多种代谢过程，包括脂质代谢、碳水化合物代谢、脂肪细胞信号通路和胰岛素信号通路等^［4-5］。

外泌体（Exosome）是由活细胞分泌的直径在30~150 nm的细胞外囊泡，广泛存在于血液、唾液、尿液和乳液等多种体液中^［6］。外泌体内部蕴含蛋白质、DNA、mRNA和miRNA等生物分子，这些成分是外泌体参与细胞间信息传递的基础^［7］。外泌体携带的蛋白质随细胞生理、病理条件的变化而变化^［8-9］。近年来，外泌体作为细胞间通信的重要媒介，在疾病诊断、药物递送等领域展现出了巨大的应用潜力。然而，关于双峰驼外泌体的研究仍处于起步阶段，尤其是不同体型双峰驼血浆外泌体的差异及其潜在功能尚未得到充分探索。

蛋白质组学技术主要研究蛋白质的组成、定性与定量、结构功能及相互作用等^［10］。本研究旨在分离鉴定双峰驼血浆外泌体，并结合串联质谱标签（tandem mass tags， TMT）技术和液相色谱串联质谱（liquid chromatograph mass spectrometer， LC-MS/MS）技术，分析来自消瘦型和正常型双峰驼外泌体的差异表达蛋白（differentially expressed proteins， DEPs），并对这些DEPs进行深入生物信息学分析。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

将10峰双峰驼根据其腹围、身高、体长等信息，进行动物身体状况评分^［11-12］，并分为消瘦型双峰驼（S组）和正常型双峰驼（Z组），每组各5峰。分别采集2组双峰驼全血，血样4 ℃保存备用。

1.2 外泌体分离

在4 ℃的条件下，使用超速离心法分离双峰驼血浆中的外泌体。对采集的全血进行离心，吸取上层血浆至新的离心管备用。采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline， PBS）稀释样品，300g离心10 min，收集上清液；2 000g离心10 min，收集上清液；12 000g离心30 min，收集上清液；120 000g离心70 min，去除上清液后的沉淀物即为外泌体^［13］。用0.22 μm 过滤器过滤后的PBS重悬外泌体，置于-80 ℃保存。使用BCA蛋白检测试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）对其浓度进行定量。

1.3 外泌体形态观察

在前人研究的基础上，采用透射电子显微镜（transmission electron microscope， TEM），对提取的外泌体的形态和超微结构进行可视化。将S组和Z组提取的外泌体分别滴加在100目的铜网上，滴加浓度为2%的醋酸双氧铀进行复染，静置于日光灯下干燥。TEM电压选择80~120 kV，直径100 nm，寻找至合适视野，观察外泌体的形态，并拍照保存。

1.4 外泌体纳米粒径鉴定

采用纳米颗粒跟踪分析技术（nanoparticle tracking analysis， NTA）进行双峰驼血浆外泌体粒径分析。将外泌体重悬液用PBS稀释500倍，混匀后用粒径分析仪进行检测。根据Soares等^［14］的方法，使用ZetaView®NTA（ZetaView Particle Metrix， Particle Metrix， Germany）评估外泌体的粒径大小，并记录检测结果。

1.5 外泌体蛋白质组学分析

将SDT裂解物（4% SDS， 0.1 mol/L Tris-HCl， pH 7.6）加入S组和Z组血浆外泌体中，沸水中浸泡15 min。14 000g离心15 min后，收集上清液，采用助滤剂样品制备（filter aided sample preparation， FASP）滤除上清中的SDT溶液^［15］。然后，使用TMT标记试剂盒（Thermo Fisher Scientific），按照生产厂家的方案标记每个样品100 μg肽。将各组标记肽混合，用Agent 1260 InfinityⅡ高效液相色谱系统进行分级。每个样品用Easy-nLC色谱系统分离，用Q Exactive质谱仪进行分析。

1.6 数据统计与生物信息分析

使用Proteome Discoverer 2.2（Thermo Fisher Scientific）软件将Q Exactive plus生成的原始数据，提交给MASCOT2.6进行蛋白质注释。根据差异倍数（fold change， FC）＞1.2/FC＜0.85和P＜0.05筛选消瘦双峰驼和正常双峰驼血浆外泌体之间的DEPs。利用Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）和David数据库（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）将筛选的DEPs进行基因本体注释（gene ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）信号通路富集分析以及亚细胞定位分析。使用STRING在线软件（https：//cn.string-db.org/，版本号为12.0）对差异蛋白进行蛋白网络互作分析。

2 结果与分析

2.1 外泌体形态学鉴定

使用超速离心法分别从消瘦双峰驼和正常双峰驼的血浆中分离外泌体，并用TEM进行观察。视野内显示，从消瘦体型双峰驼和正常体型双峰驼血浆中分离的外泌体均结构完整，大小不一，呈杯状或圆形形态，直径约为100 nm（图1）。

2.2 外泌体纳米粒径分析

NTA分析表明，消瘦双峰驼和正常双峰驼血浆外泌体的主要粒径峰分别约为123.6 nm和117.9 nm；总体尺寸分布范围为30~150 nm（图2）。研究结果与先前报道的外泌体形态特征、粒径大小一致^［7］。以上结果表明，本研究运用超速离心法从两组双峰驼的血浆中提取出的外泌体，可用于后续试验。

2.3 外泌体蛋白质鉴定

经过TMT标记及LC-MS/MS鉴定分析后，以错误发现率（false discovery rates， FDR）≤0.01的条件进行过滤，共标记4 903个肽段，鉴定846个蛋白。肽段序列长度分布如图3所示，横坐标为肽段序列的氨基酸个数，纵坐标为肽段数量，本研究中蛋白肽段长度主要集中于6~25范围内，说明肽段酶切比较合理和充分。

将鉴定蛋白质的分子质量分布进行统计，横坐标为蛋白质的分子质量，主纵坐标为蛋白质数量，对应柱状图；次纵坐标为蛋白质的累积百分比，对应累积曲线。如图4所示，分子质量在20~30 kDa的蛋白质最多，鉴定分子质量主要集中分布10~90 kDa，其累积达总蛋白质80%以上。以上结果表明，本研究得到的数据真实可靠，可继续进行分析。

2.4 外泌体差异表达蛋白分析

通过TMT标记定量分析技术，根据FC＞1.2/FC＜0.85和P＜0.05阈值，绘制S组和Z组双峰驼血浆外泌体DEPs的火山图（图5），共筛选出172个DEPs，其中上调77个蛋白，下调95个蛋白。部分DEPs信息如表1所示，其中主要的差异表达蛋白有载脂蛋白C-Ⅲ（apolipoprotein C-Ⅲ，ApoC-Ⅲ）、血管生成素（angiogenin， Ang）载脂蛋白A-II（apolipoprotein A-Ⅱ， ApoA-Ⅱ）、RAS鸟苷释放蛋白2（RAS guanyl-releasing protein 2， Rasgrp2）、补体因子B（complement factor B， CFB）等。

S组和Z组双峰驼血浆外泌体的DEPs在不同样品中的相对表达量聚类分析，显示DEPs在不同组间的表达趋势（图6），表达量较低的蛋白呈蓝色，表达量较高的蛋白为红色，结果表明筛选DEPs能够很好地区分两组不同体型的双峰驼血浆外泌体。

2.5 差异表达蛋白的生物信息学分析

筛选出的172个DEPs进一步用于GO功能注释、KEGG通路分析和亚细胞定位分析。这些差异表达蛋白的GO功能注释，从生物学过程（biological process， BP）、细胞成分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function， MF）3个方面进行功能富集分析（图7）。BP富集于蛋白酶体泛素非依赖性蛋白分解代谢过程、有丝分裂细胞周期G2/M转换的负调控、白细胞介素-1介导的信号通路和典型Wnt信号通路的正调控等。CC显著富集于蛋白酶体核心复合体、皮质细胞骨架、精子环等；MF富集于苏氨酸型内肽酶活性、脂肪酶抑制剂活性、载脂蛋白受体结合等。

172个DEPs KEGG信号通路，进一步分析表明，这些差异表达蛋白在125个通路中被富集，主要与蛋白酶体、HIF-1信号通路、补体与凝血级联信号通路、II型糖尿病及癌症中心碳代谢等信号通路有关（图8）。

筛选出的172个DEPs进行亚细胞定位分析结果表明，大多数差异表达蛋白位于细胞外（32.0%）、细胞质（25.6%）、细胞膜（15.1%）、细胞核（12.2%）和线粒体（8.7%）。少量差异表达蛋白分布在细胞骨架（2.9%）、内质网（1.7%）、过氧化物酶体（1.2%）和溶菌酶（0.6%）中，见图9。

2.6 与脂质代谢潜在相关差异蛋白的网络互作分析

利用STRING在线软件（https：//cn.string-db.org/）绘制可能与脂质代谢相关的差异表达蛋白网络互作（PPI）分析图（图10）。图中节点代表蛋白质，蛋白质之间的连线表示蛋白之间的相互作用，连线越多表示蛋白之间的相互作用关系越强。在网络互作分析图中显示，多数蛋白存在互作关系，说明所鉴定筛选出的部分差异表达蛋白在脂质代谢相关方面相互作用。

3 讨论

外泌体是蛋白质、脂质、核酸和代谢物的载体，随着研究深入，其在细胞间物质传递与信息交流领域的重要性逐渐展现^［16-17］。有研究表明，肥胖相关外泌体及其内含物miRNA在以葡萄糖耐量受损和血脂异常为病因的代谢性疾病中有重要作用^［18］。小鼠肥胖会使其血浆外泌体内含物产生改变，其外泌体可治疗消瘦小鼠并诱导葡萄糖耐量受损和胰岛素抵抗^［18］。目前有研究表明，骆驼奶外泌体能通过抑制线粒体复合物Ⅰ来调节肝细胞葡萄糖代谢^［19］。骆驼独特的代谢途径是研究糖脂代谢的重要模型，但目前对于骆驼外泌体潜在价值的了解仍然有限^［20］。因此，双峰驼个体体型的不同，其血浆外泌体内含物也不同^［21］，为了探究不同体型的双峰驼血浆外泌体的差异，本研究分离并鉴定两组血浆中的外泌体，分析其外泌体的内含物在蛋白质方面的差异。

本研究通过蛋白质组学分析表明，两种不同体型双峰驼外泌体共有172个DEPs，其中77个蛋白上调，95个蛋白下调，主要的差异表达蛋白有ApoC-Ⅲ、 ApoA-Ⅱ、 Ang、 Rasgrp2、 CFB等。分析DEPs生物信息学发现，其在脂质代谢相关的脂肪酶抑制剂活性、2型糖尿病、典型Wnt信号通路、RAS信号通路、及HIF-1信号通路等显著富集。脂质代谢紊乱会导致各种病理发展，包括代谢综合征、肥胖和2型糖尿病等^［22-23］。在人体内的脂质代谢途径中，脂肪酶抑制剂通过与胃和小肠的活性脂肪酶部分结合，改变胃/胰蛋白酶的构象，抑制催化活性，从而减少脂质（如甘油三酯）^［23］。Yao等^［24］研究揭示了Wnt信号和Ras信号通路在肝脏肿瘤发生过程中影响脂质的组成和转化。此外，HIF-1信号通路改善线粒体功能和脂质代谢，治疗动脉粥样硬化和高脂血症。本研究表明，不同体型双峰驼血浆外泌体存在蛋白质水平上的差异，且这些DEPs可能通过脂肪酶抑制剂、典型Wnt、RAS、HIF-1信号通路等与脂质代谢相关。

当骆驼饥饿、饮食减少时，驼峰中所储藏的脂肪可以通过脂质代谢转化为水分和能量供其使用。骆驼体内的激素作用于脂肪细胞，使脂肪（甘油三酯）在脂肪细胞内分解生成甘油和脂肪酸。运输到各组织细胞中的脂肪酸，在细胞内被逐步分解为乙酰辅酶A，再氧化分解为二氧化碳和水，产生的水被骆驼身体利用，维持其生命活动^［25］。本研究DEPs与脂质代谢潜在相关蛋白的网络互作分析中，筛选出ApoC-Ⅲ、ApoC-Ⅱ、ApoA-Ⅱ、ApoF等与脂质代谢相关。Apo是脂蛋白与受体结合的识别位点，脂蛋白主要功能是在血液中为水不溶性脂质充当载体，维持机体脂质代谢稳定^［26］。其中，ApoC-Ⅲ具有促炎作用，可增加高脂肪饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗，降低ApoC-Ⅲ可以预防和逆转高脂肪饮食诱导的白色脂肪组织代谢紊乱^［27］。靶向ApoC-Ⅲ的siRNA也可对抗肥胖诱导的代谢紊乱^［28］。此外，ApoA-Ⅱ是高密度脂蛋白代谢的关键调节因子，可促进胰岛素抵抗，并对脂肪稳态产生多种影响^［29］。综上所述，DEPs之间存在蛋白互作关系，并双峰驼脂质代谢的研究可能具有潜在价值，后续需要采取分子生物学等方法进行深入研究。

本研究从不同体型的双峰驼血浆中分离、提取并鉴定外泌体，共标记了4 903个肽段，筛选出172个差异表达蛋白，其中上调77个蛋白，下调95个蛋白。通过生物信息学分析发现，有这些差异表达蛋白在脂质代谢相关通路显著富集。目前双峰驼外泌体的研究仍然有限，本研究利用蛋白质组学探索不同体型双峰驼外泌体的差异，为外泌体在双峰驼脂质代谢的生理调控中的作用提供新的视角。

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基金资助

内蒙古自治区自然科学基金项目(2023MS03021)

国家自然科学基金项目(31860693)