18种石竹属材料叶绿体DNA和线粒体DNA的SSR分析及其与花表型的关联性初探

SSR Analysis of Chloroplast DNA and Mitochondrial DNA of 18 Species of Dianthus and Its Correlation with Floral Phenotypes

摘要

植物叶绿体基因组和线粒体基因组均具备母系遗传的特点，可用于明确植物遗传多样性及亲缘关系。中国石竹（Dianthus chinesis）栽培种花瓣花色丰富，本研究采用前期试验中挑选出的100对SSR引物对12种中国石竹栽培种和6种石竹属其他花卉材料的叶绿体DNA和线粒体DNA进行分析。在叶绿体DNA分析中，有30对SSR引物可扩增出多态性条带，在遗传相似系数为0.50时可聚为2个大群：第I大群包括DCPS的1~3、Dca、Dsu、Dba-Sooty、Dba-Red和Dkn，花瓣中均不含有白色部分；第II大群包括SCBS的1~3、Dch-UW、Dch和BCBS的1~5，除Dch外，花瓣均含有白色部分。在线粒体DNA分析中，有28对SSR分析可扩增出多态性条带，在遗传相似系数为0.50时可聚为2个大群：第I大群包括DCPS的1~3、Dca、Dsu、Dch、BCBS的1~5、SCBS的1~3和Dch-UW，均属于大花类；第II大群中Dkn、Dba-Sooty和Dba-Red均为小花类。基于叶绿体DNA和线粒体DNA的SSR分析，中国石竹栽培种间及其与石竹属其他花卉的遗传相似系数分别在0.46~0.73和0.45~0.68。

Abstract

This study investigated the genetic diversity and relationships of the chloroplast and mitochondrial genomes in plants， focusing on Dianthus chinensis cultivars， which exhibit a wide range of petal colors. A total of 100 SSR primers selected from a previous experiment were used to analyze the chloroplast DNA and mitochondrial DNA of 12 cultivars of Dianthus chinensis， along with 6 other plant species of Dianthus. In the chloroplast DNA analysis， amplified bands were polymorphic by 30 SSR primer pairs. There were two major clusters at a genetic similarity coefficient of 0.50. Cluster I included DCPS from 1 to 3， Dca， Dsu， Dba-Sooty， Dba-Red， and Dkn， had no white sections in their petals. Cluster II comprised SCBS from 1 to 3， Dch-UW， Dch and BCBS from 1 to 5， had white sections in their petals except for Dch. In mitochondrial DNA analysis， amplified bands were polymorphic by 28 SSR pairs. There were two major clusters at a genetic similarity coefficient of 0.50. Cluster I included DCPS from 1 to 3， Dca， Dsu， Dch， BCBS from 1 to 5， SCBS from1 to 3 and Dch-UW， had large sizes of petals. Cluster II consisted of Dkn， Dba-Sooty and Dba-Red， had small sizes of petals. The genetic similarity coefficients among the D. chinensis cultivars ranged from 0.46 to 0.73， while the coefficients between D. chinensis cultivars and other Dianthus species ranged from 0.45 to 0.68， based on SSR analysis of chloroplast and mitochondrial DNA.

Graphical abstract

关键词

石竹属 / 叶绿体 / 线粒体 / SSR / 聚类分析

Key words

Dianthus / Chloroplast / Mitochondrial / SSR / Cluster analysis

简单重复序列 （simple sequence repeat， SSR） 是指从基因组序列和转录组序列中鉴定出来的一类由1~6个核苷酸组成的串联重复单元^［1］。通过转录组测序开发出的SSR标记已用于花卉的遗传多样性分析、亲缘关系鉴定及分子指纹图谱构建^［2-4］。在被子植物中，线粒体DNA和叶绿体DNA具有母本遗传的特点，与核基因组SSR相比，细胞器基因组SSR不仅具有核基因组SSR标记的共显性、重复性好等固有特点，而且还具有很好的种属通用性，因此被广泛应用于物种起源、进化、分类及种质资源多样性分析中^［5-6］。目前，基于叶绿体DNA和线粒体DNA开发的SSR引物，已在牡丹^［7］和芍药^［8］等花卉的遗传多样性和亲缘关系分析、指纹图谱构建等方面得到应用。

石竹属（Dianthus）花卉主要分布在欧洲、美洲和亚洲等地区。中国石竹（Dianthus chinensis）、美国石竹（Dianthus barbatus）和香石竹（Dianthus caryophyllus）是石竹属植物常见的杂交亲本^［9］。香石竹是四大切花之一；瞿麦（Dianthus superbus）叶绿体基因组大小为149 539 bp，与石竹科其他植物的叶绿体基因组大小非常相近^［10］，在亚洲不仅可用作传统药材，也是很好的观赏植物。目前市场上中国石竹栽培种花色多样，是园林绿化中的良好花材。根据退火温度、核苷酸组成，有研究在前期中国石竹转录组测序中获得的大量SSR引物中挑选出100对，在基因组水平对28种石竹属花卉的遗传多样性进行了分析，发现其中的33对扩增出的条带清晰，且多态性和重复性好^［11］。本研究利用前期挑选出的100对SSR引物，对12种中国石竹栽培种和6种石竹属其他花卉材料的叶绿体DNA和线粒体DNA进行分析，揭示中国石竹栽培种间的遗传多样性及其与其他石竹属花卉的亲缘关系，进而为今后石竹属花卉新品种的选育服务。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的18种石竹属花卉包括：中国石竹（D.chinensis）栽培种12个、美国石竹（D.barbatus）栽培种2个、香石竹（D.caryophyllus）栽培种1个、克那贝石竹（D.knappii）栽培种1个，以及内蒙古自治区呼和浩特市大青山上收集的中国石竹野生种1个和瞿麦（D.superbus）野生种1个。除大青山收集的野生种外，其余材料均购自www.outsidepride.com。这些材料均种植于内蒙古农业大学温室内。

12个中国石竹栽培种中有11个双色花和1个白色单色花。中国石竹栽培种中的双色花，按照花瓣边缘有无白色及白色部分的大小分为3种类型：Type 1（small colored-bottom serials，简写为SCBS），白色部分占整个花瓣面积的2/3以上；Type 2（big colored-bottom serials，简写为BCBS），白色部分占整个花瓣面积的1/3以下；Type 3（double colored-petal serials，简写为DCPS），花瓣无白色。在11种双色花中，Type 1收集了3种，分别简写为SCBS-1、SCBS-2、SCBS-3；Type 2收集了5种，分别简写为BCBS-1、BCB-2、BCBS-3、BCBS-4、BCBS-5，其中BCBS-4和BCBS-5不仅花瓣边缘有白色，花瓣其余部分也分布有白色；Type 3收集了3种，分别简写为DCPS-1、DCPS-2、DCPS-3。1个中国石竹栽培种白色单色花的简写为Dch-UW。美国石竹栽培种D.barbatus cv. Sooty和D.barbatus cv. Red分别简写为Dba-Sooty和Dba-Red。香石竹（D.caryophyllus）栽培种简写为Dca；D. knappii栽培种简写为Dkn；中国石竹野生种简写为Dch；瞿麦野生种简写为Dsu。见图1。

1.2 叶绿体和线粒体的分离及其DNA提取

收集植株的第4~5叶用于提取叶绿体和线粒体，每个材料收集3株，即3次重复。分别采用叶绿体分离和叶绿体酶提取试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司，YLTT-2-Y，50 T）、植物线粒体提取试剂盒（碧云天生物技术公司，P0045，100 T）分离叶绿体、线粒体，将分离获得的叶绿体与线粒体置于Olympus BX53（奥林巴斯株式会社，日本）显微镜下观察其完整性，并拍照。

采用改良的CTAB法^［11］分别从分离获得的叶绿体和线粒体中提取DNA，将提取的DNA在1.0%的琼脂糖中电泳检测其完整性，在紫外分光光度计（UV1800）下测量DNA浓度后于-80 ℃下保存。

1.3 SSR引物筛选及扩增

以4种石竹属花卉SCBS-1、BCBS-1、 DCPS-1、Dca的叶绿体DNA与线粒体DNA为模板，从挑选出的100对SSR引物中进行筛选^［11］。25 μL的SSR-PCR反应体系中包括12.5 μL Taq Mix （康为世纪，CW0682M，5 mL）、1 μL Forward primer、1 μL Reversed primer、2 μL DNA、8.5 μL DEPC H₂O。扩增反应程序为：93 ℃预变性3 min；93 ℃变性30 s，57.3~62.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34个循环；最后72 ℃延伸2 min。根据PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上的检测结果，从中挑选出可扩增出清晰条带、具有多态性且重复性好的叶绿体SSR引物30对和线粒体SSR引物28对（表1）。

1.4 SSR-PCR产物检测

将SSR-PCR产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。凝胶配比为：6 mL 40%丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉=39∶1），3 mL 10×Tris-硼酸-EDTA缓冲液，21 mL去离子水，300 μL 20%过硫酸铵，25 μL 四甲基乙二胺（现用现加）。在220 V恒压条件下电泳120 min，电泳结束后用改良的银染法进行染色显影^［11］ ，待条带清晰后制成干胶在扫描仪上进行扫描并统计带型。

1.5 数据统计

采用“0”和“1”对SSR扩增产物的多态性条带进行记录，“1”表示有，“0”表示没有，进而建立一个由“0”和“1”组成的矩阵。采用NTSY-PC2.11软件对样品进行分析，用SIMQUAL方法估算样品之间的遗传相似度，用SAHN功能按照UPGMA方法对样品进行聚类，用IIIDisplay功能制作聚类结果的树形图。

2 结果与分析

2.1 18种石竹属花卉表型分析

18种石竹属材料的花瓣形态特征如表2。从花径大小看，可分为2大类：Dba-Sooty、Dba-Red和Dkn的花朵直径小于3 cm，属小花类；其余均大于3 cm，属大花类。从花序类型看，分为2大类：有伞状花序的Dba-Sooty、Dba-Red是1类，剩余16种单生枝端是1类。从花瓣着色中有无白色看，可分为2大类，其中中国石竹栽培种中SCBS的1~3（Type 1）、BCBS的1~5（Type 2）和Dch-UW花瓣上均有白色，而DCPS的1~3（Type 3）、Dch（中国石竹野生种）、Dba-Sooty、Dba-Red、Dca、Dkn、Dsu花瓣上均无白色。从花瓣上的口红看，可分为无口红的（Dch-UW、Dch、Dca、Dba-Sooty、Dba-Red、Dkn、Dsu）和有口红的材料（SCBS-1、SCBS-2、SCBS-3、BCBS-1、BCBS-2、BCBS-3、BCBS-4、BCBS-5、DCPS-1、DCPS-2、DCPS-3）。

2.2 提取叶绿体和线粒体的完整性检测

通过试剂盒提取得到的叶绿体置于Olympus BX53显微镜下观察，可以看到分离出的叶绿体呈椭圆形，直径约为3 μm，具有2层完整的膜结构，且内含类囊体结构（图2）。线粒体观察前先用健那绿染色（含无水碳酸钠、37%甲醛、1%硫代硫酸钠），盖上盖玻片染色20 min后，在Olympus BX53显微镜下，可观察到被染成蓝色的线粒体，整体呈圆形，直径约为1.5 μm，具有完整的膜结构（图2）。

2.3 18种石竹属花卉的遗传多样性分析

2.3.1 基于叶绿体基因组的SSR分析

研究采用NTSY-PC2.11软件，根据筛选出的30对叶绿体SSR引物（表1）在18种石竹属花卉叶绿体DNA的PCR扩增结果（图3），计算得出18种石竹属花卉间的遗传系数在0.46~0.73之间。根据UPGMA聚类分析结果（图4），在遗传相似系数为0.50时将18种石竹属花卉聚为2个大群：第Ⅰ大群包括DCPS的1~3、Dca、Dsu、Dba-Sooty、Dba-Red和Dkn；第II大群包括SCBS的1~3、Dch-UW、Dch、BCBS的1~5。其中，第I大群中包含3个亚群，subgroup I中均为中国石竹栽培种双色花中的Type 3；subgroup II包括 Dca和Dsu；subgroup III包括Dba-Sooty、Dba-Red 和Dkn。第II大群包含3个亚群，subgroup IV包括中国石竹双色花系列中的Type 1和纯白色花Dch-UW；subgroup V包括 Dch；subgroup VI均由中国石竹双色花系列中的Type 2组成。

2.3.2 基于线粒体基因组的SSR分析

本文根据筛选出的28对线粒体SSR引物（表1）在18种石竹属花卉的PCR扩增结果（图5），采用NTSY-PC2.11软件计算获得的18种石竹属花卉间遗传相似系数在0.45~0.80。其中，Dba-Sooty和Dba-Red遗传相似系数最大，为0.80，表明二者亲缘关系极近。聚类分析发现，遗传相似系数为0.50时，18种石竹属花卉可聚为2个大群：第Ⅰ大群包括DCPS的1~3、Dca、Dsu、Dch、BCBS的1~5、SCBS的1~3和Dch-UW；第II大群包括Dkn、Dba-Sooty和Dba-Red。第I大群可分为3个亚群，subgroup I 包括DCPS的1~3 （Type 3）、Dca、Dsu和Dch；subgroup II包括BCBS的1~5（Type 2）；Subgroup III包括SCBS的1~3（Type 1）和Dch-UW（图6）。

3 讨论与结论

中国石竹、美国石竹和香石竹是石竹属植物常见的杂交亲本^［9］。中国石竹栽培种花色多样，常用于园林绿化中。本研究在挑选出的100对SSR引物中，筛选出33对用于28种石竹属花卉材料的基因组分析，表明中国石竹转录组测序获得的SSR引物可用于石竹属花卉的遗传多样性分析^［11］。

植物的叶绿体基因组具有高度的保守型^［12］，可用于揭示品种间的亲缘关系和遗传多样性。12个多态性良好的叶绿体SSR标记可揭示牡丹的遗传关系^［13］；利用9对叶绿体SSR引物成功检测了来自不同品种群或野生类型的58份普通杏种质资源的单倍型变化^［14］；18对叶绿体SSR引物将15个苦参种质分为2个类群，分类结果可揭示一定的地域来源^［15］，利用2对叶绿体SSR引物构建指纹图谱，可完全区分10个甘薯品种^［16］。本研究利用30对叶绿体SSR引物在遗传系数为0.50时，将12种中国石竹栽培种和6种石竹属其他花卉材料聚为2个大群，聚类结果与花瓣形态结合发现：第I大群中的材料花瓣花色中均不含白色部分；第II大群中的材料除Dch（中国石竹野生种）外，花瓣花色中均含有白色部分，其中中国石竹栽培种中双色花的Type 1和Type 2分别聚在subgroup IV和subgroup VI中。由此说明，在本研究中利用叶绿体SSR标记可在一定程度上将石竹属花卉按照花瓣花色是否含有白色进行区分，同时可将双色花的着色类型区分开。基于叶绿体DNA的SSR分析，中国石竹栽培种间及其与其他石竹属花卉材料间的遗传相似系数在0.46~0.73之间，存在较远的亲缘关系。

与叶绿体DNA不一样，植物线粒体DNA存在频繁的结构重组、外源DNA序列插入和基因序列进化缓慢等特点^［17］，因此植物线粒体基因组SSR是一种具有很高的多态性和遗传信息的分子标记。李绪英等^［18］利用178对线粒体基因组SSR引物扩增出多态性条带，研究发现来自线粒体基因组的SSR标记适合用于烟草种间进化、分类、遗传多样性等方面研究；沙秀芬等^［19］利用13对线粒体SSR标记和10对叶绿体SSR标记对61份丹参品种进行了遗传多样性分析，聚类分析结果将61份丹参分为6个亚群；赵宇等^［20］利用黄瓜线粒体基因组开发的13对线粒体SSR标记构建了21份黄瓜品种的线粒体DNA指纹图谱。本研究利用28对线粒体SSR引物在遗传系数为0.50时将18种石竹属花卉聚为2个大群，第I大群中材料的花瓣均为大花，第II大群中材料的花瓣均为小花；第I大群中，subgroup I材料包括中国石竹双色花的Type 3及其他3种石竹属材料，花瓣上均无白色；subgroup II材料的花瓣上白色部分占1/3以下，为双色花的Type 2；subgroup III材料的花瓣白色面积占2/3以上，为双色花的Type 1。这表明线粒体SSR标记可将石竹属花卉按照花径大小进行区分，同时可将花瓣白色着色类型区分开。基于线粒体DNA的SSR分析，中国石竹栽培种间及其与其他石竹属花卉材料间的遗传相似系数在0.45~0.68之间，亲缘关系较远。

基于叶绿体SSR的聚类结果和基于线粒体SSR的聚类结果的相同之处是它们都与花瓣的形态学特征有关，二者均能按照花瓣上白色着色类型对18种石竹属花卉进行区分，基于线粒体SSR获得的聚类结果还可按照花瓣花径大小进行区分。叶绿体和线粒体是植物光合作用和能量代谢的重要场所，研究表明二者均与花色苷的形成有关^［21-23］。这可能是本研究中基于叶绿体DNA和线粒体DNA的SSR分析均与花色有关联的原因。二者聚类结果也存在不同，如在叶绿体SSR中，Dba-Sooty和Dba-Red及SCBS-1和SCBS-3之间的遗传相似系数高，而在线粒体SSR中，Dba-Sooty和Dba-Red的遗传相似系数高；但SCBS-1和SCBS-3的遗传相似系数不高。可能的原因：①中国石竹栽培种多数是通过复杂的组间杂交育成的，因此各个种之间的亲缘关系错综复杂；②线粒体基因组的突变率高于叶绿体基因组，且两者多态性和遗传变异存在差异^［24］。

综上所述，中国石竹栽培种间遗传多样性丰富，基于叶绿体DNA和线粒体DNA的SSR聚类结果可揭示石竹属花卉材料的花瓣形态学特征。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31960611)

内蒙古自治区自然科学基金项目(2021MS03041)