青海省蚕豆赤斑病牡丹葡萄孢病原菌分离鉴定、生物学特性及致病性分化研究

Study on Isolation， Identification， Biological Characteristics and Pathogenicity Differentiation of the Pathogen of Broad Bean Chocolate Spot in Qinghai Province

摘要

为明确青海省蚕豆赤斑病病原菌牡丹葡萄孢（Botrytis paeoniae）的生物学特性及其致病能力的相关特征，该研究通过组织分离法从病斑组织中分离并纯化获得目标菌株，综合运用形态学观察、分子生物学鉴定和生物学特性进行分析，并选用青海省12个蚕豆资源进行了致病性评估。形态学特征：菌落边缘规则，菌核呈不规则分布，菌丝呈淡褐色，具二叉分枝结构及隔膜，其分生孢子多呈卵形至梨形，分生孢子梗呈圆形，微着色或近透明。分子鉴定：基于ITS和G3PDH基因序列分析，确认该病原菌为牡丹葡萄孢。生物学特性：牡丹葡萄孢在PDA培养基上生长最快，最适碳源为葡萄糖，氮源以牛肉膏和硝酸钾效果最佳，其最适pH为中性（pH 7），光照条件下以12 h光照/12 h黑暗或24 h连续光照更有利于其生长。致病性分化：不同的蚕豆资源对病原菌的敏感性不同，其中对‘云122’的致病作用最为显著。

Abstract

To clarify the biological characteristics and pathogenicity of Botrytis paeoniae， the pathogen of broad bean red spot in Qinghai Province， the target strain was isolated and purified from the lesion tissue by using a tissue separation method. The morphological observation， molecular biological identification and biological characteristics were used for analysis， and 12 broad bean resources in Qinghai Province were selected for pathogenicity evaluation. Morphological characteristics revealed that the colony edge was regular， the sclerotium was irregularly distributed， and the mycelium was light brown， with a two-branched structure and a diaphragm. The conidia were mostly oval to rod-shaped， and the conidiophores were round， light brown or nearly transparent. Molecular identification based on ITS and G3PDH gene sequence analysis confirmed the pathogen as Botrytis paeoniae； Biological characteristics indicated that Botrytis paeoniae suffruticosa grew fastest on PDA medium. The optimum carbon source was glucose， and the optimum nitrogen source was beef extract and potassium nitrate. The optimum pH was neutral （pH 7）. Under light conditions， 12 h light / 12 h dark or 24 h continuous light was more conducive to growth. Pathogenicity differentiation showed that different faba bean resources had different sensitivities to pathogens， and the pathogenic effect on 'Yun 122 ' was the most significant.

Graphical abstract

关键词

蚕豆赤斑病 / 牡丹葡萄孢 / 生物学特性 / 致病性

Key words

Broad bean chocolate spot disease / Botrytis paeoniae / Biological characteristics / Pathogenicity

蚕豆（Vicia faba L.）是一种主要的豆科作物^［1］，可作为粮食、蔬菜、饲料、绿肥及药材，具有养人、养畜、养地的“三养”功能^［2-4］，还含有蛋白质、糖类、矿质元素、维生素及钙、铁等多种营养^［5-6］，兼具不可忽视的营养价值和一定的经济价值。同时，蚕豆具有生物固氮作用，可将大气中的氮素分子转变成可利用的氮素物质，进而提高土壤的氮素水平^［7］。蚕豆是全球第三大冬豆作物，亚洲种植面积居首，占全球种植总面积一半以上^［8］。在我国，该作物的种植面积已达7.02×10⁸ hm²，占全球总量的三分之一（33.7%），年产量高达1.429×10⁶ t，位居世界第一^［9］。主要种植于云南、四川、甘肃等地，其中江苏、上海和青海的单位面积产量最高^［10-12］。蚕豆作为青海地区优势经济作物，在当地农业结构优化过程中发挥着不可忽视的关键作用。该地区蚕豆籽粒饱满、大粒、病虫害少，是全球唯一无豆类虫蛀的产区，其优良特性使其广受国内外市场青睐，其中日本蚕豆年进口量的50%就来源于青海，且呈逐年增长趋势^［13］。然而，受气候变化和人为因素的影响，蚕豆面临的病虫害问题呈现出不可忽视的加剧趋势，尤其在温暖湿润的环境条件下易暴发流行，造成蚕豆产量巨大损失^［14］。

在蚕豆的叶部病害中，较为常见且具有代表性的是赤斑病（由Botrytis fabae、 Botrytis cinerea及Botrytis fabiopsis等多种病原真菌引起）、褐斑病（由蚕豆壳二孢 Ascochyta fabae引起）、霜霉病（由蚕豆霜霉Peronospoora viciae引起）、锈病（由蚕豆单胞锈菌Uromyces viciae引起）等^［15］，其中蚕豆赤斑病（broad bean chocolate spot）是严重危害蚕豆生产的一类真菌性病害，其致病因子为葡萄孢属复合体^［16-17］，在我国蚕豆主产区广泛分布。近年来，甘肃发病率显著上升^［18］，2020年，甘肃渭源和临夏等地区发病田块比例接近100%，平均减产量突破30%^［4］。在蚕豆赤斑病病原菌鉴定方面，渭源县的蚕豆赤斑病病原菌为蚕豆葡萄孢（B. fabae）^［4］，江苏南通的为拟蚕豆葡萄孢（B. fabiopsis）^［19］。我国8省市314份病样的系统鉴定显示，B. cinerea、B. fabae和B. fabiopsis的分离株数分别为110株、84株和120株^［20］。马生彪等^［4］研究发现，蚕豆葡萄孢在马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose agar，PDA）培养基上生长性能最为优越；营养需求方面，乳糖和酵母膏分别是最适碳源和氮源；环境适应性测试表明，其生长最有利的温度条件为20 ℃，适宜的酸碱环境为pH 8，光照因素对其生长未表现出显著的促进或抑制作用。

本课题组在前期工作中对青海省蚕豆主产区进行了系统的病害样本采集，对青海省4个州市12个区县的143个村子352块地里700个病样进行分离纯化和鉴定^［21］。结果显示，共发现11种引起蚕豆赤斑病的病原菌，其中发现的桉树灰霉菌（Botrytis eucalypti）为蚕豆赤斑病上的寄主新记录种^［22］，引发青海省蚕豆赤斑病的主要优势种包括灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、拟蚕豆葡萄孢（Botrytis fabiopsis）、欧美葡萄孢（Botrytis euroamericana）、蚕豆葡萄孢（Botrytis fabae）、牡丹葡萄孢（Botrytis paeoniae）。该研究选取牡丹葡萄孢的代表性的菌株样本，开展形态结构观察、分子生物学鉴定以及生物学特性测定，明确病原菌的特征，并进行致病性鉴定，旨在明确青海地区蚕豆赤斑病牡丹葡萄孢的形态与分子特征、生长发育与环境因子的关系，以及其对不同寄主的侵染能力。本研究不仅为阐明高寒地区蚕豆赤斑病的病原多样性和流行规律提供科学依据，也为抗病品种选育及病害综合防控策略的制定提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试资源（12份）：‘云122’、‘沙珠玉尕蚕豆’、‘马牙’、‘陵西一寸’、‘青海11号’、‘青海12号’、‘青海13号’、‘青蚕14’、‘青蚕20’、‘VF12’、‘GF13’、‘VF1’。

供试菌株：TR030A，该菌株于2023年采集于青海省黄南藏族自治州同仁市都乎乡向阳村。

供试培养基：本研究以察氏培养基为基础，评估不同类型碳源（葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖）和多种氮源（硝酸钠、蛋白胨、尿素、甘氨酸、硝酸钾）对病原菌菌丝生长营养需求的影响；同时，选用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、水琼脂（WA）、燕麦片琼胶（OMA）及Czapek培养基^［23］。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离与纯化

采用组织分离法分离病原菌^［24-25］。将采集的病叶样品经自来水充分冲洗后，使用无菌操作技术从病健交界处切6~8片3~4 mm²的组织块，样本依次经75%乙醇表面消毒30~45 s、3%~5% NaClO溶液消毒30~35 s，并用无菌蒸馏水冲洗3遍，随后转移至无菌滤纸上自然晾干。接着，均匀分布接种于预先制备的PDA培养基平板中（每皿约放5块），在25 ℃恒温且避光的条件下进行持续培养5~7 d，再进行1~2次纯化。再取5个直径6 mm的纯化病原菌菌柄接入PDB液体培养基中，在25 ℃、180 r/min条件下振荡培养3 d，过滤获得孢子悬浮液。悬浮液中加入吐温后喷洒在6叶期健康蚕豆植株上，发病后重复分离步骤进行科赫氏法则验证。最后，获得的纯化病原菌再次接种至PDA固体培养基中，25 ℃避光条件下培养至少7 d，置于4 ℃低温环境中以备后续使用。

1.2.2 柯赫氏法则验证

采用离体叶片接种法评估蚕豆赤斑病菌株TR030A的致病力。利用无菌打孔器对纯化后的菌株切取菌饼（直径5 mm）备用。供试蚕豆叶片经75%乙醇和5%NaClO溶液表面灭菌处理后，充分晾干，放置于预先经灭菌并有保持湿润状态滤纸铺设的无菌皿中，再将菌饼接种于叶片表面，同时设置接种无菌PDA培养基圆片处理，以作为阴性对照。接种完成的培养皿在25 ℃恒温、避光条件的人工气候箱中培养，以24 h为间隔定期监测病斑的发展动态并做好记录。培养期间通过喷水和加湿装置维持适宜湿度。持续培养96 h后，对蚕豆叶片病症表现进行观察与记录^［26］。

1.2.3 病原菌的形态学鉴定

供试菌株接种于PDA固体培养基平板，于25 ℃条件下在恒温装置中培养5 d后，对菌落的色泽及形态特性进行初步评估。在分生孢子形成后，通过显微镜观察分生孢子梗形态特征及分生孢子显微结构^{［14，27］}。

1.2.4 病原菌的分子生物学鉴定

采用CTAB改良法提取病原菌基因组DNA。先使用微量核酸定量仪对DNA样品进行纯度及浓度检测，随后通过1.2%琼脂糖凝胶电泳进行电泳分析验证DNA完整性。以病原菌的ITS区段和G3PDH^［28］基因序列作为分子标记进行PCR扩增。本研究中使用的特异性引物（具体信息见表1）委托杨凌天润奥科生物科技有限公司进行合成。完成DNA扩增后，对产物实施纯化处理，随后将纯化后的产物交由生物工程（上海）股份有限公司开展测序工作。获取测序所得的序列后，将其提交至NCBI数据库（网址：https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）开展BLAST同源比对分析。同时，运用MEGA11.0软件，采用邻接法（neighbor-joining， NJ）构建系统发育树，以此确定待测菌株的具体种类^［29-30］。

1.2.5 生物学特性测定

使用直径为5 mm的打孔器截取菌饼，并将其接种于培养基的正中央位置，随后设定如下处理组别，每个处理3次重复。

碳源、氮源对菌丝生长的影响：采用察氏培养基体系，分别设置不同碳源（蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖）和氮源（硝酸钠、尿素、硝酸钾、甘氨酸、蛋白胨）处理组，以基础察氏培养基（不含碳氮源）作为空白对照。各处理组置于25 ℃恒温培养箱中进行暗培养^［31］。

pH对菌丝生长的影响：通过１ mol/L的HCl溶液和１ mol/L的NaOH溶液梯度调节PDA培养基pH值（5、7、8、9、10、11）。采用平板接种法，将菌株接种至不同pH处理培养基中央，25 ℃黑暗条件下培养^［32］。

光照对菌丝生长的影响：设置4种光周期处理：全光照（24 h连续光照）、间歇光照（12 h光照+12 h黑暗）、长日照（16 h光照+8 h黑暗）和全黑暗（24 h连续黑暗），各处理组接种于PDA培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中进行培养^［33］。

培养基对菌丝生长的影响：采用标准菌饼接种法，将供试菌株的纯培养物接种至4种不同培养基（Czapek、PDA、WA及燕麦培养基）中，置于25 ℃恒温培养箱中进行避光培养^［34］。

当培养时长达到5 d时，运用十字交叉法对各平板上菌落的直径进行测量，且每个处理均设置3次重复，并使用Graphpad Prism 10.1.2进行作图^［35-36］。

1.2.6 病原菌致病性测定

采用无菌操作技术，使用直径5 mm打孔器从目标菌株纯培养物中获取5个菌饼，接种至PDB液体培养基内，在20 ℃恒温摇床内，以120 r/min的转速进行振荡培养，直至菌体进入产孢阶段。经血球计数板测定孢子浓度（1×10⁵ 个/mL）后，再将调配好的孢子悬液通过人工喷雾的方法均匀施用于处于六叶期的蚕豆叶片表面（正反两面），然后在温室进行培养。在接种后第14天，对植株病情进行观察评估，并依据发病症状分级标准（见表2）计算发病等级^［37］。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与统计分析

通过对青海省4个州市、12个区县共143个村庄352块地里采集的700个蚕豆赤斑病病样进行分离纯化及形态学和分子鉴定，共获得病原菌268株。其中，葡萄孢属（Botrytis）病原菌占据绝对优势，共计235株，占总数的87.7%。进一步统计分析表明，不同种类的葡萄孢属病原菌在蚕豆赤斑病病样中分布存在明显差异（图1）。

从分离频率来看，B. cinerea的检出率最高，共分离出80株，占比34.0%，显示其在青海地区蚕豆赤斑病发生中处于优势地位。其余依次为B.fabiopsis（33株，14.0%）、B.euroamericana（32株，13.6%）、B.fabae（28株，11.9%）及B.paeoniae（26株，11.1%），这几类病原菌的分离频率接近，表明蚕豆赤斑病的发生与牡丹葡萄孢的侵染密切相关，该菌是其主要致病因子之一。

2.2 病原菌的形态鉴定

病原物侵染叶片后，能够在叶片表面形成范围较大的褐色病斑。将分离菌株在25 ℃恒温条件下培养5 d时，菌丝将培养皿表面完全覆盖，直径90 mm，发育形成具典型浅棕褐色泽的菌落。显微结构观察显示，菌丝呈二叉分枝状，具明显隔膜结构。分生孢子形态多态性明显，主要呈现卵形至梨形两种形态；分生孢子梗呈近圆形，顶端具有分枝结构。分生孢子色泽为微着色或无色透明，经显微测微尺测量，测得其大小范围为（16.0~18.0）×（7.0~7.5）μm。综合该病原菌的形态特征及显微下的形态表现，初步判定其归属于葡萄孢属（Botrytis，图2）。

2.3 柯赫氏法则验证

对菌株TR030A进行室内致病性回接试验，接种处理48 h后，供试蚕豆叶片表面开始出现黑色坏死病斑（直径2~3 mm），随着病程发展，病斑呈放射状扩展至叶缘，伴随周缘褪绿发黄。该症状表现与田间自然发病植株的病征无明显差异（图3-A），相比之下，对照组的叶片始终保持健康状态（图3-B）。通过对人工接种后发病的叶片进行分离操作，成功获取到了纯培养物，在菌落形态、显微结构等关键分类学指标上与原始接种菌株TR030A高度吻合。严格遵循柯赫氏法则，确认TR030A菌株是青海省蚕豆赤斑病的致病真菌。

2.4 分子生物学鉴定

基于TR030A的形态学分析，为更精准地明确其具体种类归属，后续应用分子生物学相关技术手段进行分类地位精确鉴定。BLAST分析结果表明，菌株TR030A的ITS序列与GenBank中Botrytis cinerea（PP781280.1）序列同源性达到99%，ITS将菌株TR030A鉴定为葡萄孢属（图4-A）。将菌株TR030A的G3PDH基因序列上传至GenBank数据库，进行同源性的比对分析，基于比对结果，采用Mega11.0软件结合邻接法（neighbor-joining，NJ）构建G3PDH序列的系统发育树。在该软件中，设置重复Bootstrap method 1 000次对其稳定性进行评估。分析结果显示，目标菌株TR030A与牡丹葡萄孢（KR055045.1）在系统发育树形成稳定的单系群（bootstrap支持率>70%），共同聚类于同一进化分枝（图4-B）。因此，根据TR030A回接蚕豆后所引发的致病状况、其在PDA培养基上呈现出的菌落形态特点，以及通过显微镜观察所获取的分生孢子形态构造等，结合系统发育树的分析，最终将TR030A鉴定为牡丹葡萄孢（Ｂ. paeoniae）。该菌株的ITS和G3PDH基因序列已提交至NCBI数据库，分别获得PV933215、PV941748两个基因登录号。

2.5 病原菌的生物学特性

2.5.1 不同碳源对病原菌生长的影响

菌株TR030A在供试的4种碳源及无碳对照培养基上均表现出一定程度的生长能力，但不同碳源处理组间菌丝生长存在显著差异（P＜0.05，图5）。在单糖类（葡萄糖和果糖）培养基中，该菌株呈现最优生长态势，培养5 d后菌落直径分别达到77.69 mm、76.63 mm，显著优于其他碳源处理组（P＜0.01）。二糖类碳源（蔗糖）处理组菌落直径为73.59 mm，虽略低于单糖处理组，但相较乳糖组（58.50 mm）仍具明显优势。无碳源对照组菌落直径仅为42.81 mm，与各碳源处理组均存在极显著差异（P＜0.01）。结果显示，葡萄糖为该病原菌株的最佳生长碳源。

2.5.2 不同氮源对病原菌生长的影响

菌株TR030A在供试的6种氮源及无氮对照培养基上均表现出一定程度的生长能力，与不同碳源处理的结果相似，其生长速率也有较大的差异（图6）。该病原菌对不同氮源适应性排序为牛肉膏＞硝酸钾＞硝酸钠＞蛋白胨＞无氮对照（CK）＞甘氨酸＞尿素。以无氮源培养基作为参照，其中有机氮源牛肉膏表现出最优促生长效果，培养5 d后菌落直径达75.00 mm，显著优于其他氮源处理组；无机氮源硝酸钾次之，菌落直径为73.85 mm。相比之下，含尿素和甘氨酸的培养基显著抑制了菌丝生长，其中甘氨酸处理组菌落直径（32.15 mm）仅略高于尿素处理组（15.59 mm）。尿素作为氮源时表现出最强的生长抑制作用，菌落直径仅为无氮对照组的36.5%，表明尿素对于此病原菌并非适宜的氮源类型。

2.5.3 不同pH对病原菌生长的影响

由图7可知，菌株在pH 5~11的范围内均能维持较为稳定的生长状态，菌落直径波动范围较小（介于72.83~76.50 mm），差异不显著。相较之下，中性条件（pH 7）下菌丝生长最快，菌落直径为76.50 mm。总体来看，菌株表现为对pH不敏感。

2.5.4 不同光照条件对病原菌生长的影响

如图8所示，菌株TR030A在4种不同的光照处理条件下（12 h光/12 h暗、16 h光/8 h暗、24 h连续光照、24 h连续黑暗）均表现出较好的生长能力，其菌落直径分别为68.88 mm、64.66 mm、69.50 mm、64.06 mm。在持续光照（24 h）与光暗交替循环（12 h光照/12 h黑暗）两种条件下，该菌株的菌落长势未发现明显差别，其扩展速度相对接近。而在持续黑暗环境中，菌丝扩展速度相对较缓，较最优光照条件（持续光照）的菌落直径减小约5.3%，显示出光照对该菌株生长的正向调控作用。

2.5.5 不同培养基对病原菌生长的影响

从图9可以看出，不同培养基处理对蚕豆赤斑病病原菌菌丝生长的影响表现出显著差异性（P<0.05）。经5 d培养后，PDA培养基处理组菌落直径达到70.93 mm，显著优于在其他培养基处理组（P<0.01）。燕麦培养基（OMA）处理组次之，菌落平均直径为60.91 mm；而水琼脂（WA）和察氏培养基处理组的菌落生长明显受限，直径分别为55.05 mm和53.65 mm，与PDA和OMA处理组均存在显著差异（P<0.05）。

2.6 病原菌致病性测定结果

由表3结果可知，未见叶片对接种菌块表现出完全的抗病性，均出现了病害症状。‘云122’的病斑面积占整个叶片的39.67%，显著高于其他资源（>2倍），表现出强致病力，发病等级达到5级；‘VF12’病斑面积为16.33%，发病等级达到3级，‘VF12’、‘青海13’和‘青海14’的病斑面积在10%~20%之间；其余8个资源病斑面积均在10%以下，其中‘青海11’和‘陵西一寸’病情最轻，仅为5.22%，其稳定性也较好（SD≤0.44），是抗病育种的优选材料。

3 讨论

蚕豆赤斑病作为影响全球蚕豆生产的主要真菌性病害，其致病因子主要为葡萄孢属（Botrytis）病原真菌。在我国不同蚕豆产区，该病害呈现出一定程度的病原种群多样性及地理分布异质性。研究表明，不同生态区及栽培品种的赤斑病病原菌组成存在明显差异。例如，湖北省蚕豆种植区域经鉴定已明确存在3种致病菌，分别为灰葡萄孢（B.cinerea）、蚕豆葡萄孢（B.fabae）和拟蚕豆葡萄孢（B.fabiopsis）^［16］。值得关注的是，拟蚕豆葡萄孢这一菌种，其首次被发现的地域为湖北地区^［38］，此后在国内多省及国外均有相继报道^［39-40］。而甘肃渭源县‘临蚕9号’品种上仅检出蚕豆葡萄孢单一病原菌^［4］。陈华等^［41］对青海省多个主要蚕豆种植区域病叶样本研究，确定其致病菌为灰葡萄孢。在江苏南通下辖的吴窑镇，王凡等^［19］仅检测并鉴定出1种蚕豆赤斑病的致病菌——拟蚕豆葡萄孢（Botrytis fabiopsis）。黄燕等^［39］对我国西北、华东及华中部分省份的蚕豆赤斑病病原菌进行鉴定，共鉴定出以上3种病原菌。在青海省的研究中，除确认上述3种主要赤斑病致病菌外，喻敏博^［21］还进一步分离得到了另外6种病原菌。Ran等^［22］2023年在青海省最新研究发现了1种新型病原菌——桉树灰霉菌（B.eucalypti），在国内首次报道。本研究以青海省多个主产区采集的赤斑病样本为基础，通过形态学和分子生物学相结合的方法，共鉴定出11种致病菌，从中选取优势菌群中的代表性菌株TR030A作为供试材料。

研究病原菌的生物学特性有助于深入理解其致病过程和流行规律，掌握病原菌在不同环境条件下的生理反应，从而为制定科学、有效的病害防控策略（如施药时间、栽培管理措施）提供理论依据。该研究结果显示，菌株TR030A对碳源的利用效率呈现出葡萄糖＞果糖＞蔗糖的梯度趋势，该结果与马生彪等^［4］对甘肃渭源县蚕豆葡萄孢的生物学特性研究结果不一致，其研究中蔗糖处理下的菌落直径显著低于对照组，这可能与菌株间蔗糖水解酶活性多态性有关。在氮源代谢方面，本研究与马生彪等^［4］的研究均证实甘氨酸对菌丝生长具有显著抑制效应（P＜0.05）。在筛选适宜氮源的研究中发现，尿素对病原菌的生长非但无促进作用，反而具有一定的抑制效果，这一现象与张静^［16］对湖北地区病原菌生物学特性的研究结论相左，其研究表明尿素是B.fabae和B.cinerea的最适氮源，这种代谢差异可能源于TR030A菌株脲酶系统功能缺陷，或其尿素分解产物（如氨）造成微环境pH值升高，也可能是其菌株地域适应性分化，从而抑制菌丝生长。基于上述分析，在蚕豆栽培管理中可考虑适量施用甘氨酸和尿素作为生态防控措施。

青海高海拔干寒的气候环境，在一定程度上可能更易促使病原菌发生变异、加速传播与扩展，并可能诱导其形成新的生理小种，从而导致其致病性发生适应性演化^［42］。致病性测定是研究该病害的关键环节，对于明确病原菌种类、评估菌株致病力、筛选抗病品种及制定防控策略具有重要意义。本研究通过对采集于青海省不同地区的蚕豆赤斑病病原菌进行分离纯化，选用其中的1个病原菌对12份蚕豆资源进行侵染。结果发现：病原菌在侵染不同蚕豆资源时，均存在致病力，其中1份蚕豆资源病害等级为5，另外11份蚕豆资源病害等级均为3，未出现其他病害等级（1、7、9），可能是因为所用菌株或者品种较少，可在后期使用更多菌株及品种进行试验。

4 结论

在青海省，蚕豆赤斑病的发生与牡丹葡萄孢（Botrytis paeoniaee）的侵染密切相关，该菌是其主要致病因子之一。该病原菌菌丝在PDA培养基上生长最快，最适碳源为葡萄糖，氮源以牛肉膏和硝酸钾效果最佳，最适pH为7，光照条件以12 h光照/12 h黑暗或24 h连续光照更有利于其生长。该菌株对不同的蚕豆资源表现出不同的致病性，其中对‘云122’致病性最强。

参考文献

[1] POLIGNANO G B， BISIGNANO V， ALBA V. Two field bean （Vicia faba L. var. minor Peterm.） breeding selections for a potential agronomic and industrial use［J］. Genetic Resources and Crop Evolution，2015，62（7）：971-977.

[2] 刘玉皎，张红岩，郭兴莲，等. 基于“一优两高”战略的蚕豆产业认知与产业发展［J］. 青海科技，2020，27（6）：18-21.

[3] 周仙莉，滕长才，张红岩，等. 蚕豆遗传图谱与QTL定位研究进展［J］. 江苏农业学报，2021，37（1）：237-245.

[4] 马生彪，王立，蒋晶晶，等. 蚕豆赤斑病病原菌分离鉴定及生物学特性研究［J］. 西北农业学报，2021，30（11）：1724-1732.

[5] 崔占鸿，刘书杰，柴沙驼，等. 青海高原苜蓿青干草与农作物秸秆组合效应评价［J］. 西北农业学报，2012，21（2）：146-152.

[6] 庄应强，屠娟丽，费伟英，等. 不同鲜食蚕豆品种产量性状及营养成分比较［J］. 安徽农业科学，2018，46（32）：52-54.

[7] 刘玉皎. 调结构，转方式，促进青海蚕豆产业转型升级［J］. 青海科技，2018，25（1）：35-37.

[8] 焦春海. 国际蚕豆改良的进展和趋势［J］. 湖北农业科学，1989，28（10）：35-37+40.

[9] 叶茵. 中国蚕豆学［M］. 北京：中国农业出版社，2003.

[10] 沈良. 江苏省蚕豆主要病害鉴定及赤斑病药剂防治研究［D］. 南京：南京农业大学，2014.

[11] 袁璟亚，谢正伟，戚兰，等. 不同杀菌剂对‘成胡15’蚕豆赤斑病防治效果试验［J］. 南方农业，2015，9（36）：7-9.

[12] 刘陈玮，王凡，卞晓春，等. 蚕豆根腐病病原菌鉴定与生物学特性及室内防治药剂筛选［J］. 西北农业学报，2025，34（7）：1356-1364.

[13] 柴国贤，吴妍雯. 青海蚕豆：世界上最好的蚕豆［J］. 中国检验检疫，2013（6）：51-52.

[14] MIRZAEI S， GOLTAPEH E M， SHAMS-BAKHSH M，et al. Identification of Botrytis spp. on plants grown in Iran［J］. Journal of Phytopathology，2008，156（1）：21-28.

[15] 陈新，袁星星，崔晓艳，等. 蚕豆病害研究进展［J］. 江西农业学报，2011，23（8）：108-112+123.

[16] 张静. 湖北省灰霉病病菌区系和灰葡萄孢菌多样性研究［D］. 武汉：华中农业大学，2010.

[17] MENGESHA G G， TEREFE H， CHELEKO D C. Progression of chocolate spot （Botrytis fabae） and grain yield of faba bean as influenced by integration of fungicide rate and host resistance in Southern Ethiopia［J］. Journal of Crop Science and Biotechnology，2022，25（1）：73-90.

[18] 仲彩萍，孙新荣，漆文选，等. 高寒阴湿区鲜食春蚕豆赤斑病的发生与防治［J］. 蔬菜，2018（5）：52-54.

[19] 王凡，卞晓春，刘陈玮，等. 南通市蚕豆赤斑病病原菌鉴定及其抑菌药剂筛选［J］. 江苏农业学报，2024，40（10）：1810-1817.

[20] 黄燕. 蚕豆赤斑病病原菌的鉴定及抗性资源筛选［D］. 秦皇岛：河北科技师范学院，2012.

[21] 喻敏博. 青海省蚕豆赤斑病病原菌的种类鉴定及抗性资源筛选［D］. 西宁：青海大学，2022.

[22] RAN Y L， YU M B， HOU L，et al. First report of chocolate spot caused by Botrytis eucalypti on faba bean in China［J］. Plant Disease，2024，108（6）：1884.

[23] 潘阳，朱晓峰，王媛媛，等. 大豆毛口壳叶斑病菌产毒素的研究［J］. 植物病理学报，2011，41（6）：596-603.

[24] TIAN F H， LI C T， LI Y. First report of Penicillium brevicompactum causing blue mold disease of Grifola frondosa in China［J］. Plant Disease， 2017， 101（8）： 1549-1549.

[25] 刘瑜，魏彩霞，周世兴，等. 天山野果林塞威士苹果和短距凤仙花叶斑病病原真菌的鉴定［J］. 植物保护学报，2019，46（2）：345-351.

[26] 汪汉成，黄宇，黄洋，等. 烟草叶斑病病原菌的鉴定及其生物学特性［J］. 植物保护学报，2023，50（3）：757-766.

[27] 李培谦，冯宝珍，赵燕飞，等. 芍药红斑病病原菌鉴定、生物学特性及有效药剂筛选［J］. 核农学报，2023，37（8）：1533-1541.

[28] ZIETKIEWICZ E， RAFALSKI A， LABUDA D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification［J］. Genomics，1994，20（2）：176-183.

[29] CHEN X R， LIU B B， XING Y P，et al. Identification and characterization of Phytopythium helicoides causing stem rot of Shatangju mandarin seedlings in China［J］. European Journal of Plant Pathology，2016，146（4）：715-727.

[30] 高飞，谢源，潘鑫，等. 2019—2020年河南省小麦茎基腐病病原菌鉴定及致病力测定［J］. 植物保护学报，2023，50（2）：298-305.

[31] 谷清义，黄晨晨，武志鹏，等. 芍药黑斑病病原菌的分离鉴定、生物学特性及植物源药剂筛选［J］. 中药材，2024，47（10）：2428-2433.

[32] 刘俏，宁楠楠，马永强，等. 青海省樱桃叶斑病菌生物学特性及室内药剂毒力测定［J］. 植物保护，2021，47（3）：136-143+176.

[33] 王佐乾，潘竹青，张舒，等. 湖北省黄连炭疽病的病原鉴定及其生物学特性［J］. 湖北农业科学，2020，59（24）：117-121.

[34] 薛彩英，武海燕，马庆周，等. 河南省草莓棒孢叶斑病病原菌鉴定及其生物学特性［J］. 植物保护学报，2023，50（2）：402-412.

[35] 王春勇，陈志，董艾美，等. 大果型番茄杂交组合表型性状遗传多样性分析［J］. 内蒙古农业大学学报（自然科学版），2025，46（5）：1-7.

[36] 袁潇潇，彭科琴，赵志博，等. 贵州省黑皮鸡枞蛛网病病原菌的鉴定及其生物学特性分析和防控药剂筛选［J］. 植物保护学报，2023，50（3）：780-790.

[37] 张贵，喻敏博，侯璐，等. 青海省22份蚕豆种质资源对赤斑病的抗性鉴定［J］. 青海大学学报，2021，39（3）：67-73.

[38] ZHANG J， WU M D， LI G Q，et al. Botrytis fabiopsis，a new species causing chocolate spot of broad bean in Central China［J］. Mycologia，2010，102（5）：1114-1126.

[39] 黄燕，段灿星，陆鸣，等. 蚕豆赤斑病病原菌鉴定［J］. 植物保护，2012，38（6）：115-118.

[40] BANKINA B， STODDARD F L， KANEPS J，et al. Botrytis four species are associated with chocolate spot disease of faba bean in Latvia［J］. Zemdirbyste-Agriculture，2021，108（4）：297-302.

[41] 陈华，喻敏博，侯璐，等. 青海省蚕豆赤斑病主要病原菌分离鉴定、生物学特性研究及室内药剂筛选［J］. 四川农业大学学报，2024，42（2）：315-321.

[42] 杨东，王慧，程军奇，等. 近50年青海省气候变化特征及其与ENSO的关系［J］. 生态环境学报，2013，22（4）：547-553.

基金资助

现代农业产业技术体系——国家食用豆产业技术体系基金项目(CARS-08)

青海省农林科学院创新基金项目(2023-NKY-05)