苜蓿源UDP-鼠李糖合成酶MtNRS/ER的克隆、表达与酶学特性研究

摘要

鼠李糖是植物细胞壁果胶、多糖以及多种次级代谢产物的重要组成单元，对天然产物活性及植物细胞壁结构具有关键影响。本研究从蒺藜苜蓿中克隆了双功能UDP-鼠李糖合成酶基因MtNRS/ER，并构建以pET30为载体的大肠杆菌表达系统。通过优化诱导条件（IPTG 0.2 mmol/L,16℃，14 h），获得大量可溶性重组蛋白，并经Ni-NTA亲和层析与HiTrap Q HP阴离子交换层析两步纯化，最终纯度>98%、浓度10 mg/mL。体外酶学实验表明，MtNRS/ER可催化UDP-4-酮-6-脱氧葡萄糖向UDP-鼠李糖转换，液相质谱鉴定确认了反应产物。动力学分析获得K_m=（373.0±7.2）μmol/L,V_max=（143.77±11.41）μmol/min，体现出良好的底物亲和力和催化效率。本研究首次揭示了植物双功能MtNRS/ER酶的协同催化机理，为UDP-鼠李糖生物合成途径酶学研究提供了实验依据，并为稀有脱氧糖及其衍生天然产物的生物合成与代谢工程应用奠定了基础。

关键词

UDP-鼠李糖合成酶 / 重组蛋白表达 / 酶动力学 / 液相质谱 / 蒺藜苜蓿