绿豆种质资源农艺性状和SSR分子标记的遗传多样性分析

Analysis of Genetic Diversity in Agronomic Traits and SSR Molecular Markers of Mung Bean Germplasm Resources

摘要

绿豆的研究水平远远落后于大宗作物，在品种选育方面进展缓慢，为了多种手段相结合探究绿豆遗传多样性，本研究利用田间形态性状标记和SSR分子标记相结合的手段对来自不同地区的91份绿豆种质资源进行遗传多样性分析。结果表明，复叶叶形和荚宽遗传多样性最大，复叶叶形和单株荚数的变异系数最大。质量性状和数量性状的平均遗传多样性指数分别为0.599 3、1.951 6，平均变异系数分别为0.326 9、0.245 5。表型性状UPGMA聚类可将材料分为5个类群。第Ⅰ类群与第Ⅲ类群综合表现较好；对不同种质材料进行主成分分析，共有11个主成分的特征值大于1，累积贡献率为70.752%，91份绿豆材料中综合表现最好的品种是CL0009。6对SSR引物共检测出23个多态性条带，通过SSR分子标记可将绿豆种质资源分为6个类群。本研究结果可为绿豆新品种培育提供理论参考。

Abstract

Research on mung bean （Vigna radiata） trails significantly lags behind that of major crops， resulting in relatively slow progress in variety development. To investigate the genetic diversity of mung bean， this study analyzed 91 germplasm accessions from different regions using a multi-faceted approach that combined field-based morphological markers and SSR molecular markers. Morphological traits exhibited the highest level of genetic diversity， with compound leaf shape and pod width showing the largest coefficients of variation （CVs）. The mean genetic diversity indices for qualitative and quantitative traits were 0.599 3 and 1.951 6， respectively， with corresponding mean CVs of 0.326 9 and 0.245 5. UPGMA clustering based on phenotypic traits categorized the accessions into five clusters， with Clusters I and III showing superior overall performance. Principal component analysis （PCA） of the germplasm accessions identified eleven principal components （PCs） with eigenvalues greater than 1， collectively explaining 70.752% of the total variance. Among the 91 mung bean accessions， CL0009 exhibited the best overall performance. Additionally， six pairs of SSR primers detected 23 polymorphic bands， classifying the mung bean germplasm accessions into six clusters. These results provided a theoretical basis for mung bean variety breeding and improvement.

Graphical abstract

关键词

绿豆 / 农艺性状 / SSR标记 / 遗传多样性

Key words

Mung bean / Agronomic traits / SSR markers / Genetic diversity

我国是绿豆主产国之一，种质资源丰富，自20世纪80年代中期进行品种改良工作，虽然起步晚，但进展较快，解决了我国绿豆品种中存在的生育期长、蔓生倒伏、产量低、抗性和适应性差等问题^［1-2］。然而正是市场上对于绿豆优质、高产的高要求，也导致绿豆的遗传基础狭窄，具有优异基因的种质资源丢失。因此，对绿豆种质资源的正确评价与鉴别，是优异基因的挖掘利用和种质资源保护的基础。遗传多样性对于作物的改良和育种具有十分重要的作用，遗传变异丰富，代表作物本身具有丰富的基因变化能力，更容易适应环境变化，同时更容易进化。研究作物的遗传多样性，能对各种基因资源进行合理有效的利用和保护^［3］。本研究利用田间形态性状标记和SSR分子标记相结合的手段对来自不同地区的91份绿豆种质资源进行遗传多样性分析，以期为绿豆种质资源的保护和深度利用提供指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料是来自内蒙古自治区、黑龙江省、辽宁省、吉林省、山西省和江苏省等6个不同地区的91份绿豆种质资源，如表1所示。

1.2 田间试验设计

试验地位于内蒙古自治区呼和浩特市内蒙古农业大学东科技园区（45°5'N，110°E，海拔1 063 m）。供试材料于2022年5月下旬播种，9月中下旬收获。试验采用随机区组设计，田间管理方式同一般大田管理。

1.3 形态学性状调查

参照《绿豆种质资源描述规范和数据标准》^［4］，每份绿豆种质材料随机选取3~5株，对18个质量性状进行调查、分级和赋值及12个数量性状进行测定，如表2所示。

1.4 SSR-PCR反应及电泳检测

取各供试材料幼嫩叶片0.1 g，采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组提取试剂盒提取基因组DNA，利用1%琼脂糖凝胶对其进行电泳检测。

选用SSR引物主要来源于参考文献［5-13］，从中选出条带清晰，多态性较好的6对SSR引物用于本次研究，如表3所示。PCR反应体系积为20 μL，其体系包括上、下游引物（0.5 μmol/L）各0.9 μL，模板 DNA 2.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U） 0.1 μL，dNTPs（0.225 mmol/L） 1.4 μL，10×PCR Buffer（含Mg²⁺）2.0 μL和12.7 μL的ddH₂O。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，50~56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃反应终止。PCR扩增产物用6% PAGE聚丙烯酰胺凝胶检凝胶电泳检测。

1.5 数据分析

对绿豆18个质量性状分别赋值。对12个数量性状做分级处理：1级<X-2δ，10级>X+2δ，中间每隔0.5δ为一级，X为平均值，δ为标准差，共分为10级^［14］。利用Excel 2021对数据进行统计和整理。计算质量性状出现的频率，并计算各数量性状极值、均值、标准差和变异系数。采用Shannon-Weaver法计算各数据遗传多样性指数（H）。其计算公式如下，其中i为某一性状的等级，p_i 为N个等级中第i种等级样本在总样本数中所占的百分比^［15］。

H=-{\displaystyle \sum _{i=\mathrm{0}}^n}{P}_i\mathrm{l}\mathrm{n}{P}_i（1）

采用SPSS 25.0进行主成分分析，利用R语言中的ggtree包，采用非加权平均法（UPGMA）进行聚类分析。

电泳图在相同迁移位上统计条带，将有条带的计为“1”，无条带或条带较弱计为“0”，以此形成“0-1”矩阵，利用popogene 32计算有效等位基因数（Ne）、Nei's基因多样性指数（H）、Shannon 信息指数（I）。引物间的多态信息含量：P=（K/N）×100%。利用R语言ggtree包软件NJ邻接法对绿豆91份种质材料的SSR统计进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 绿豆农艺性状遗传多样性分析

对绿豆材料的质量性状进行多样性分析，如表4所示，各质量性状的平均变异系数为0.326 9，变异范围0.130 1~0.493 1，其中复叶叶形这一指标的变异系数最大，生长习性的变异系数最小。18个质量性状中，复叶叶色、复叶叶形、叶片茸毛密度、小叶叶缘、叶片尖端形状、叶片大小、叶柄色、叶柄茸毛密度、叶脉色、小叶基部色、主茎色、主茎茸毛密度、主茎茸毛颜色等13个性状的变异系数均超过30%，变异较大，具有丰富的变异性，其余质量性状的变异系数不超过30%，变异较小，具有稳定的遗传特性。各材料遗传多样性指数范围为0.144 9~0.980 3，平均为0.599 3，其中复叶叶形的指数最大，与变异系数表现一样，而多样性指数最小的是小叶数目，与变异系数表现不同。遗传多样性指数最大的为复叶叶形，最小的为小叶数。

2.2 绿豆数量性状基本统计量分析

各数量性状的平均变异系数为0.245 5，变异范围0.080 7~0.697 8，单株产量的变异系数最大，荚宽的变异系数最小，如表5所示。12个数量性状中，只有单株荚数和单株产量这2个性状的变异系数超过30%，变异较大，变异性丰富，其余数量性状的变异系数不超过30%，变异较小，具有稳定的遗传特性。各材料遗传多样性指数范围为1.879 1~2.086 6，平均数为1.983 1，其中指数最大的性状是荚宽，指数最小的是单株产量，与变异系数表现相反。说明绿豆材料之间存在较大差异，具有丰富的遗传多样性，利于特异种植材料的比较和筛选。

2.3 各农艺性状聚类分析

91份绿豆材料进行聚类分析分为5大类群，如图1所示。第Ⅰ类群包括21份材料，全部来自于内蒙古，该类群在主茎粗、分枝级数、荚长、单株荚数、单荚粒数、单株产量这6个性状中表现最好，分别为12.01 mm、3.19级、10.38 mm、52.79个、11.80个、24.57 g，但粒长较小，属于小粒高产种质。第Ⅱ类群包括19份材料，含有来自山西省的3份材料，来自吉林省的2份材料，以及来自内蒙古的14份材料，该类群株高最高，多为高杆种质材料，但产量一般。第Ⅲ类群包括25份材料，1份来自黑龙江，1份来自山西省，其余23份材料均来自于内蒙古，该类群粒宽最宽，属于大粒高产种质材料。第Ⅳ类群包括25份材料，含有内蒙古15份种质材料，辽宁省2份种质材料，黑龙江3份种质材料，山西省2份种质材料，江苏省1份种质材料以及吉林省1份种质材料。这一类群种质资源来源较丰富，主茎分枝数和百粒重表现最好。第Ⅴ类群只有编号28一份材料，来自于内蒙古。其荚宽较宽，粒长较长，属于大粒型种质材料，但在株高、主茎粗、分枝级数、单株荚数、百粒重、单产、粒宽这些产量相关性状表现一般。由此得知，第Ⅰ类群与第Ⅲ类群综合表现较好；第Ⅰ类群与第Ⅴ类群部分性状间表现为互补关系。

2.4 各农艺性状主成分分析

对绿豆种质资源30个农艺性状进行主成分分析，11个主成分特征值大于1，累积贡献率70.752%，涵盖大部分指标信息，如表6所示。第1主成分（特征值4.458、贡献率14.859%）以单株产量、粒宽、荚长、单株荚数、单荚粒数、百粒重（特征向量均>0.600）为高载荷性状，属产量因子；第2主成分（特征值3.080、贡献率10.266%）以百粒重、荚宽、复叶叶色、叶片尖端形状（特征向量均>0.4）及单株荚数、叶柄色、叶脉色（负向高载荷）为关键性状，属叶片颜色因子；第3主成分（特征值2.273、贡献率7.576%）以分枝级数、主茎分枝数、主茎粗、株高（高载荷）及主茎色（负向高载荷）为核心性状，属生长因子；第4主成分（特征值2.046、贡献率6.819%）以粒色为高载荷性状，属籽粒颜色因子；第5主成分（特征值1.681、贡献率5.603%）以花蕾色、小叶数目为高载荷性状，属花蕾颜色因子；第6主成分（特征值1.544、贡献率5.145%）以主茎茸毛密度、叶片大小、复叶叶形为高载荷性状，属主茎茸毛因子；第7主成分（特征值1.503、贡献率5.011%）以复叶叶形、小叶数目为高载荷性状，属叶片形态因子；第8主成分（特征值1.243、贡献率4.142%）以叶片尖端形状、主茎色为高载荷性状，属叶片形态因子；第9-11主成分特征值相对平均，贡献率较小。

2.5 绿豆材料形态学综合评价

将标准化后的91个性状值代入到11个主成分中：

F₁=0.793X₁+0.784X₂+0.760X₃+0.698X₄+0.635X₅+0.619X₆-0.504X₇+0.272X₈+0.413X₉+0.107X₁₀+0.461X₁₁+0.229X₁₂+0.079X₁₃+0.226X₁₄+0.193X₁₅-0.07X₁₆+0.049X₁₇+0.126X₁₈+0.324X₁₉-0.201X₂₀+0.286X₂₁+0.105X₂₂+0.165X₂₃+0.2X₂₄+0.112X₂₅-0.113X₂₆+0.098X₂₇-0.24X₂₈+0.067X₂₉-0.258X₃₀

F₂=-0.226X₁+0.199X₂+0.382X₃-0.442X₄-0.332X₅+0.466X₆+0.361X₇-0.526X₈+0.513X₉+0.502X₁₀-0.486X₁₁+0.249X₁₂+0.234X₁₃-0.28X₁₄-0.24X₁₅-0.021X₁₆+0.324X₁₇-0.017X₁₈+0.333X₁₉-0.394X₂₀+0.205X₂₁-0.03X₂₂-0.096X₂₃+0.184X₂₄-0.237X₂₅+0.414X₂₆-0.326X₂₇-0.099X₂₈+0.023X₂₉-0.326X₃₀

以此类推，可得到11个主成分公式，根据以上所得F₁~F₁₁数值及各主成分的贡献率权重计算综合评价（F）值：

F=0.210F₁+0.145F₂+0.107F₃+0.096F₄+0.079F₅+0.073F₆+0.071F₇+0.059F₈+0.056F₉+0.053F₁₀+0.051F₁₁。F值越大，表型综合性状越好。排名前10的品种分别是CL0009、ZY430、ZY91、ZY118、20-284、东北绿豆、徐科绿豆、20-310、消暑绿豆、ZY175，如表7所示。

2.6 SSR多态性分析

6对条带清晰、多态性高的引物，共检测出23个条带，全部为多态性条带，每对引物检测的位点数在3~5个，多态性比率为100%。91个供试材料的有效等位基因数变幅在1.739 0~1.963 7之间，平均为1.852 3，Nei's基因多样性指数（H）在0.423 9~0.490 6之间，平均为0.457 3；Shannon 信息指数（I）在0.614 8~0.683 7之间，平均为0.649 2；多态性信息含量（PIC）变化区间是45.79%~64.10%，平均为54.32%，如表8所示。

2.7 SSR聚类分析

基于SSR分子标记，以NJ邻接法对91个绿豆材料聚类，结果显示91个材料可分为6类，如图2所示，第Ⅰ类3个品种（ZY489、绿霸1号，内蒙古；龙博11号，吉林）；第Ⅱ类4个品种（ZY536、ZY507、ZY63、ZY102），均来自内蒙古；第Ⅲ类14个品种（ZT506、ZY538、中绿5等），均来自内蒙古；第Ⅳ类12个品种（厚绿1号、大明绿豆等），5份来自内蒙古，其余分别来自山西（大明绿豆、大至绿豆王）、辽宁（消暑绿豆）、江苏（徐科绿豆）、黑龙江（绿丰2号）、吉林（洮绿9号、龙博6号）；第Ⅴ类16个品种（ZY283、ZY437等），矮脚懒汉绿豆、华欣毛绿1号来自山西，小明绿来自黑龙江，其余来自内蒙古；第Ⅵ类材料最多（42个，占参试品种46.15%），含丰绿1号、绿宝石等，37份来自内蒙古，其余分别来自辽宁（丰绿1号）、山西（绿宝石、绿宝绿豆王）、黑龙江（黄绿豆、河引1号）。

3 讨论

性状是基因型与环境因素相互作用下的结果，在不同品种，不同个体中一般会表现出不同程度的差异^［16］。本试验对91份绿豆种质资源的30个农艺性状进行多样性分析，其中包括18个质量性状和12个数量性状。质量性状遗传多样性指数为0.599 3，数量性状遗传多样性指数为1.983 1，数量性状的遗传多样性指数远远大于质量性状，这与任红晓^［17］、陈文晋等^［18］的研究一致，原因可能是数量性状受环境、气候等影响较大，而质量性状不受环境所影响，因此，应对质量性状和数量性状分别进行讨论。质量性状中遗传多样性指数最大的性状为复叶叶形，最小的性状为粒色，这与龙珏臣等^［19］的研究结果一致。数量性状中遗传多样性指数最大的性状为荚宽，最小的性状为单株产量，其中，百粒重与株高的遗传多样性指数较高，这与朱慧珺等^［20］的研究基本一致。从变异系数上看，数量性状中变异系数最大的性状为单株产量和单株荚数、最小的性状为荚宽，与郑海泽等^［21］的研究基本一致。质量性状中复叶叶形的变异系数最大，生长习性变异系数最小。综合遗传多样性指数和变异系数分析发现，质量性状中，遗传多样性指数越高，变异系数越大，而数量性状中，遗传多样性指数越高，变异系数反而越低。

本试验主成分分析得到11个特征值大于1的主成分因子，累计贡献率为70.752%，证明该11个主成分能够描述91个品种的大部分信息。陈红霖等^［22］对481份参试绿豆种质材料的12个性状进行主成分分析，结果表明前6个主成分对表型变异的累计贡献率达到了83.41%。康泽然等^［23］对20份绿豆种质资源的10个性状进行主成分分析，结果表明前4个主成分累计贡献率达到79.193%，均高于本研究的分析结果，原因可能是与本研究参与主成分分析性状较多有关。通过参试品种综合评价得分可知，排名前10的品种，这些材料在产量相关性状中表现突出，可作为重要育种材料。

本研究91个供试绿豆材料的有效等位基因数变幅在1.739 0~1.963 7之间，平均为1.852 3，Nei's基因多样性指数（H）在0.423 9~0.490 6之间，平均为0.4573；Shannon信息指数（I）在0.614 8~0.683 7之间，平均为0.649 2，这与张雨朋等^［24］的研究结果相似。多态性信息含量（PIC）变化区间是45.79%~64.10%，平均为54.32%，与赵雅楠等^［25］的研究结果相似，说明筛选的引物多态性较为丰富。本研究共扩增出23个条带，多态性比率为100%，与赵雅楠等^［26］在辽宁地区绿豆品种SSR指纹图谱构建及品种鉴定中的研究结果一致。

本研究对表型性状（18个质量性状、12个数量性状）与SSR分子标记分别聚类，结果存在差异，表型聚类中ZY41单独属于第Ⅴ类群，分子聚类中其属第Ⅵ类群。可能因表型调查指标多、调查者主观因素影响，且两种聚类的方式与基础数据不同^［27］。综上，表型聚类与分子标记聚类结合，更能说明材料的遗传多样性。

4 结论

本研究对91份绿豆种质进行农艺性状遗传变异和聚类分析，结果表明，这些材料具有丰富的遗传多样性，91份绿豆种质可划分为5类。基于主成分分析进行综合评价筛选出CL0009、ZY430、ZY91等表现优异的材料。6对SSR引物扩增多态性比率为100%，有效等位基因数平均为1.852 3，Nei's基因多样性指数（H）平均为0.457 3，Shannon信息指数（I）为0.649 2，多态性信息含量（PIC）为54.32%。本研究结果明确了91份绿豆种质的遗传分化程度及遗传多样性水平，为今后绿豆种质鉴定和新品种培育的研究提供了理论基础。

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基金资助

内蒙古农业大学博士科研启动基金项目(BJ08-8)

国家自然科学基金项目(31302021)

内蒙古自治区自然科学基金项目(2010MS0502)