沙柳混合发酵对柠条青贮饲料发酵品质及微生物群落结构的影响

Effect of Mixed Fermentation with Salix cheilophila on Quality and Microbial Community Structure of Caragana korshinskii Silage

摘要

柠条（Caragana korshinskii）和沙柳（Salix cheilophila）是防风固沙的优良灌木，平茬是其抚育管理的重要措施，而平茬物利用是亟须解决的问题。本文对两种灌木平茬物进行了青贮加工研究，试验分为柠条单独青贮（NT）和柠条沙柳（1∶1）混合青贮（NTS）两组，每组重复3次，从感官、营养、品质及微生物多样性等方面进行了综合分析。结果显示：NT组青贮料清香微酸，而NTS组青贮料酸味刺鼻。NT组相较于NTS组，粗脂肪（CF）、酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）、灰分（Ash）等无显著差异（P>0.05），而粗蛋白（CP）和氨基氮（NH₃-N）的含量显著提高（P<0.05），木质素（Lignin）含量显著下降（P<0.05）；甲酸、乳酸、乙酸、戊酸、丁酸等含量都没有显著差异（P>0.05），但异丁酸含量显著下降。NTS组相较于NT组，微生物多样性升高，群落结构改变，厚壁菌门（Firmicutes）、担子菌门（Basidiomycota）和乳杆菌属（Lactobacillus）丰度值显著下降，蓝藻门（Cyanobacteria）、子囊菌门（Ascomycota）、明串球菌属（Leuconostoc）、假茎点霉属（Nothophoma）、克努夫菌属（Knufia）、小壳孢菌属（Camarosporidiella）显著上升。综上，在柠条青贮中添加沙柳使青贮饲料感官和品质下降。这为柠条青贮饲料的研究提供理论基础，为柠条次生产业链高质量发展提供借鉴和思考。

Abstract

Caragana korshinskii and Salix cheilophila are excellent shrubs for windbreak and sand-fixation. Coppicing is a key measure for their tending and management， while the utilization of coppiced biomass is an urgent issue to be solved. Two silage treatments were evaluated in this study： ensiling of C.korshinskii alone （NT） and ensiling of a 1∶1 mixture of C. korshinskii and S. cheilophila （NTS）， with three replicates per treatment. A comprehensive analysis was carried out from the aspects of appearance， nutrition， quality and microbial diversity. The results showed that the ensiling sample of the NT group had a fragrant， mildly acidic aroma， while that of the NTS group had a sour， pungent odor. Compared with the NTS group， the NT group had no significant differences in crude fat （CF）， acid detergent fiber （ADF）， neutral detergent fiber （NDF）， and ash （Ash） （P>0.05）， but the contents of crude protein （CP） and ammonia nitrogen （NH3-N） were significantly increased （P<0.05）， and the content of lignin was significantly decreased （P<0.05）； There were no significant differences in the content of formic acid， lactic acid， acetic acid， valeric acid， and butyric acid （P>0.05）， but the content of isobutyric acid was significantly decreased. Compared with the NT group， the microbial diversity of the NTS group increased， and the community structure changed. The abundance values of Firmicutes， Basidiomycota， and Lactobacillus significantly decreased， while Cyanobacteria， Ascomycota， Streptococcus， Nothophoma， Knufia， and Camarosporidiella significantly increased. Adding S. cheilophila to C. korshinskii silage negatively affected the sensory characteristics and fermentation quality of the silage. This provides a theoretical foundation for the research of C. korshinskii ensiling feed and offers a reference and insights for improving the high-quality development of the secondary industrial chain of C. korshinskii.

Graphical abstract

关键词

青贮 / 柠条 / 沙柳 / 营养成分 / 发酵品质。

Key words

Silage / Caragana korshinskii / Salix cheilophila / Nutrient composition / Fermentation quality

柠条（Caragana korshinskii）和沙柳（Salix cheilophila）作为内蒙古平原干旱和半干旱地区的重要灌木，具有显著的防风固沙功能。柠条生命力强、种子萌发率高、根系发达，其丰富的营养含量使其成为当地家畜的重要饲料来源。而沙柳则以其快速生长和无性繁殖的特点，在北方干旱和半干旱荒漠地区具有重要的生态和经济价值。因此，二者作为防风固沙的先锋灌木被广泛种植。截至2022年，仅内蒙古境内柠条种植面积已超过415.3万hm²，其中库布齐沙漠的柠条林总面积约为2.1万hm²，约占整个库布齐沙漠面积的1.49%^［1-2］。近年，内蒙古防沙治沙工作在不断发展，柠条和沙柳的种植也得到了进一步的推广^［3］。

柠条枝叶茂盛，富含多种生物活性成分，其多个器官还含有丰富的营养物质，含有一定的蛋白质、粗脂肪和矿物元素含量；此外，还含有17种氨基酸，组成较为均衡且必需氨基酸比一般秸秆饲料含量高。柠条是干旱区家畜蛋白质饲料的来源之一，含粗蛋白质22.9%、粗脂肪4.9%、粗纤维27.8%；种子中含粗蛋白质27.4%、粗脂肪12.8%、无氮浸出物31.6%。沙柳作为我国西北干旱地区的优势灌木，具有显著的生态和饲用价值。其枝叶和嫩枝的干物质中粗蛋白（CP）含量可达12%~15%，接近优质牧草苜蓿的水平，且中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）分别占45%~55%和30%~40%，表明其兼具蛋白质和能量供应潜力。通过青贮或生物发酵处理，沙柳的营养价值可显著提升^［4］。

而平茬抚育管理是实现灌木资源可持续利用的关键环节，通常需要每3~5 a对柠条和沙柳进行一次平茬^［5-7］。其平茬物制作成颗粒饲料是一种重要的利用方式。然而，与颗粒饲料相比，青贮饲料具有更好的保鲜、保营养和长时间贮藏优势。由于柠条生长期短，木质化速度快、程度高，适口性不佳等问题限制了其作为饲料的应用。青贮技术不仅能够延长柠条的最佳饲用期，还能通过软化硬质部分提高其适口性。

本研究旨在探讨添加沙柳对柠条青贮的感官品质、营养价值、发酵品质和微生物菌群结构的影响，为柠条和沙柳灌木的资源利用和饲料产业的发展提供科学依据，为防风固沙和农业生态系统的可持续发展作出贡献。

1 材料与方法

1.1 试验地及试验材料

柠条和沙柳平茬物采集于内蒙古鄂尔多斯市鄂托克旗4月份的人工柠条林和沙柳林（107°58′E，北纬39°05′N）。鄂托克旗气候属于典型的温带大陆性季风气候，日照时间长，每天的日照时数为8 h左右，四季分明，无霜期短，降水少且时空分布极为不均，降水主要集中在7—9月份，日降水量0.69 mm左右，蒸发量大，日蒸发量8 mm左右，年平均气温6.4 ℃左右（数据来源于当地气象局）。

1.2 试验设计

将11月份平茬的柠条和沙柳分别用家用粉碎机进行粉碎，粉碎至约2 cm大小碎屑。本试验设置2组方案，分别为柠条青贮组（NT）、柠条和沙柳按1∶1（质量比）混合青贮组（NTS）。为了保证青贮顺利进行，在青贮处理前，均添加10%蔗糖。用开水放凉，溶解蔗糖后加入，边加边拌匀，使青贮前的含水量在65%。使用∅30 cm×50 cm的小桶青贮，每组各重复3次。NT组每桶称取2.5 kg柠条和0.25 kg蔗糖；NTS组每桶称取1.25 kg柠条、1.25 kg沙柳和0.25 kg蔗糖。两组分别混合均匀取样留存用于检测营养成分，其余分别入桶按相同力度压实。于25 ℃的室温青贮100 d。采用四分法取样，分别进行营养成分、发酵品质以及微生物多样性的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 营养成分的测定

从各组分别取200 g柠条样品委托内蒙古谱尼测试技术有限公司测定粗灰分、总糖（可溶性碳水化合物，WSC）、粗蛋白、粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、木质素、氨基酸态氮等营养成分。采用GB/T 6438—2007的方法测定粗灰分的含量，用固定量的酸和碱，在特定条件下消煮样品，再用醚、丙酮除去醚溶物，经高温灼烧后所剩的量即为粗灰分；采用斐林氏容量法方法测定总糖含量；粗蛋白含量通过凯氏定氮法（GB/T 6432—2018）测定；粗纤维含量使用过滤法（GB/T 6434—2006）测定；中性洗涤纤维含量采用GB/T 20806—2006的方法，使用中性洗涤剂分解大部分细胞内含物，所剩便是中性洗涤纤维的量；酸性洗涤纤维含量通过（NY/T 1459—2022）测定，使用酸性洗涤剂清洗后所剩余的物质即酸性洗涤纤维；木质素含量由GB/T 20805—2006的方法测定，与ADF的测定较为类似；采用GB 5009.235—2016的方法测定氨态氮含量，利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以酸度计测定终点。

1.3.2 发酵品质的测定

按照许庆方等^［8］的方法，采用高效液相色谱法测定甲酸（formic acid，FA）、乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）、丁酸（butyric acid，BA）、异丁酸（isobutyric acid，IBA）和戊酸（valeric acid，VA）等有机酸的含量。

有机酸标准品的制备：准确称取FA、LA、AA、PA、BA等有机酸标准品，用超纯水稀释后定容至100 mL，制成标准混合储备液，之后将储备液逐级稀释成1 g·L^-1、2 g·L^-1、3 g·L^-1、4 g·L^-1、5 g·L^-1系列混合标准液，经0.22 μm滤膜去除杂质、超声脱气后待上机分析。

浸提液的制备：取20 g青贮样品放置于三角瓶中，加入80 mL超纯水，用封口膜封口后于4 ℃放置24 h，将浸提液过滤后，经过0.22 μm滤膜除杂，之后上样分析。

色谱条件：色谱柱为NTS18（Xaqua） 4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相为0.01 mol·L^-1磷酸氢二铵，流速为0.8 mL·min^-1；柱温为28 ℃，进样量为20 μL，检测器紫外波长为210 nm。

根据柠条青贮饲料的营养价值和发酵品质等多个方面评价青贮饲料品质^［9］。

1.3.3 微生物群落分析

使用CTAB法提取NT组和NTS组样品的DNA，重复3次，以稀释后的基因组DNA为模版，采用细菌通用16SrDNA引物27F（5'-AGAGTTTGACCTGGCTAG-3'）和1495R（5'-CT ACGGCTCCTTGTTCGA-3'）进行扩增。采用真菌通用引物ITS1-F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2-R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′）对真菌核糖体RNA基因的内转录间隔区（ITS1）进行PCR扩增。扩增产物委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行高通量测序，使用demux插件拆分原始序列数据。随后，采用DADA2算法对原始序列进行质量控制，包括质量过滤、降噪、合并和去除嵌合体。并以100%的序列相似度阈值生成扩增子序列变体（amplicon sequence variant，ASV）。随后，使用SILVA_138数据库对细菌ASV进行物种注释，使用UNITE 8.0数据库对真菌ASV进行物种注释，最后对ASV丰度表进行归一化处理，将归一化深度设为最低样本序列数的95%，对真菌和细菌的微生物菌群结构和多样性进行分析。

1.4 数据统计与分析

使用WPS软件、Excel软件对数据进行统计整理，使用Graphpad prism 10.0软件对营养成分和发酵品质进行单因素方差分析，使用NovoMagic分析微生物群落的变化，评估不同青贮补充物对柠条青贮的影响。

2 结果与分析

2.1 两种方案青贮饲料的感官比较

NT组和NTS组分别压实覆膜于25 ℃室内发酵100 d后，终止发酵。NT组青贮料清香，味道微酸，有甜味，无积水，黄绿色，平均含水量61.67%±2.01%，pH 3.60。NTS组青贮料有酸味刺鼻，桶内有积水，黄绿色，平均含水量58.00%±1.73%，pH 3.64。

2.2 两种方案青贮饲料营养成分比较分析

比较NT和NTS两组不同方案青贮前和发酵100 d的营养成分，由图1可知，NT组和NTS组青贮饲料的ASH无显著差异；其他营养成分在青贮前后均呈现显著性差异。从青贮100 d的数据均值看，两组CF、NDF和ADF相差无几，说明青贮后两组纤维素含量大体相同。而木质素含量数据显示，在青贮前，NTS组显著高于NT组，说明沙柳中木质素含量高于柠条含量；而青贮100 d后，两组均能显著降解木质素，最终NT组木质素含量显著低于NTS组。粗蛋白和氨基酸态氮数据显示，0 dNT组含量显著高于NTS组，而100 d后粗蛋白仍显著高于NTS组，氨基酸态氮略高于NTS组，无显著性差异；通过比较分析氨态氮与粗蛋白的比值，NT组2.26%，而NTS组1.90%，显著差异。

2.3 两种方案青贮饲料中有机酸的比较分析

采用外标法，利用HPLC测定两组样品中乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、丁酸、异丁酸等有机酸的含量（图2）。NT组的甲酸和乳酸含量高于NTS组（FA：1 280→880；LA：1 606→1 194），而NT组中戊酸和异丁酸均低于NTS组（VA：54→109；IBA：112→1 612）但差异均不显著（P>0.05）；两组的乙酸、丙酸和丁酸也无显著差异（P>0.05）。通过比较乳酸、戊酸、异丁酸含量，NT组发酵品质优于NTS组。

2.4 不同青贮条件对细菌群落的影响

2.4.1 青贮过程中细菌Alpha多样性分析

两种方案青贮细菌群落的α多样性见表1，与NT组相比，NTS组的香农均匀度、香农指数和辛普森指数均有所提高，可见其菌群丰度和多样性较高。而NT组的优势度指数较高，说明在其微生物群落中优势生物的生态功能更加突出，也说明了其产生的乳酸菌产酸能力更强。

2.4.2 两种方案青贮后的细菌群落组成

两种青贮饲料中细菌群落在门、属分类水平上的组成如图3所示。主要的门包括厚壁菌门（Firmicutes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）等。添加沙柳后的厚壁菌门整体丰度有所下降，相对丰度从NT组的85.2%降为NTS组的59.8%，取而代之的是蓝细菌门，在添加沙柳组（NTS）中较多（平均值为20.23%）。而在NT组中，相对丰度很低，最高仅为1.25%。而变形菌门在两组中差异不是很大，NTS组稍高于NT组（平均值分别为17.98%和13.13%）。

图3中涉及的属主要包括布氏乳杆菌属（Lentilactobacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）以及绿脓杆菌属（Pseudomonas）等。布氏乳杆菌属和明串珠菌属都属于厚壁菌门。布氏乳杆菌属在NT组的青贮条件中大量存在（平均值为52.98%），但在NTS组中很少（平均值为2.55%）。而在NTS组中，明串珠菌属丰度值明显高于NT组（平均值分别为12.42%和3.91%）。此外，在NTS组中检测出大量的未知叶绿体基因序列，丰度值仅次于明串珠菌属，位于第二（平均值为20.16%），但在NT组中，几乎没有（平均值为0.82%）。

2.4.3 两种方案青贮后的细菌Beta多样性分析

如图4所示，PC1和PC2可以分别解释87.49%和8.72%细菌群落结构差异，2个主成分累计解释了两种方案中样品细菌群落组成的96.21%。NTS组和NT组的样品在PC1轴向距离远，表明两组的群落结构差异性较大。即说明两组物种组成结构差异较大，群落结构相似度很低^［10］。而NTS组中NTS1与另2个重复样品在PC2轴向距离较远，但NTS2与另2个重复样品在PC1轴向也存在一定距离，PC1轴比PC2轴所占比重大很多，表明NTS组3个重复样品的重现性不如NT组。表明添加沙柳原料后增加了细菌群落结构差异的复杂性。

2.5 不同青贮条件对真菌群落的影响

2.5.1 两种方案青贮后真菌Alpha 多样性分析

两种方案青贮后样品真菌群落的α多样性见表2，各组细菌微生物覆盖率均大于0.99，表明在此测序深度进行的真菌群落分析足够可靠。

由表2可知，NTS组的丰富度估计量和优势度指数相较NT组高，表明NTS组真菌菌群多样性相比较高，但NT组整体比NTS组香农均匀度高，可见其菌群分布较为均匀。而NT的香农指数高于NTS组，说明其真菌菌群丰度较高。

2.5.2 两种方案青贮后真菌的群落组成

两种青贮饲料在门分类和属分类水平上的真菌群落组成如图5所示，图中占据优势地位的门主要包括子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）等。从整体来看，在所有青贮样品中子囊菌门占据优势，相对丰度值高于75%；其次是担子菌门，两个门的丰度值均达到95%左右。在NTS组中子囊菌门丰度值略高于NT组（平均值分别为88.18%和81.60%），而担子菌门丰度值在NT组中略高（NTS平均值7.78%，NT平均值13.08%）。

在属分类水平上，两种方案样品真菌群落涉及到的主要属包括假茎点霉属（Nothophoma）、克努夫菌属（Knufia）和小壳孢菌属（Camarosporidiella）以及其他未知菌属。NT组的菌属分布较为均匀，排名前十的菌属仅占到41%，其他菌属占比较多。而NTS组的部分菌属优势较大，其中假茎点霉属达到了46%，NT组仅有5%。此外，NT组的小壳孢菌属仅占4%，而NTS组占比达到12%。

2.5.3 青贮过程的真菌Beta多样性分析

如图6所示，PC1和PC2可以分别解释64.51%和16.89%真菌群落结构差异，2个主成分累计解释了两种方案中样品细菌群落组成的81.40%。NTS组和NT组的样本距离较远，表示物种组成结构差异较大，群落结构相似度很低。而NT组和NTS组的样本距离相对较近，表明其真菌群落结构差异较小。

3 讨论

3.1 两种方案中沙柳对青贮发酵品质的影响

虽然柠条和沙柳都属于低WSC的灌木，但其平茬废弃物的高值利用是急需解决的问题。为了弥补因低WSC而导致青贮品质不易控制的因素，在两个青贮方案中都添加了10%的蔗糖作为补充。青贮饲料好坏判断最直接的因素是感官评定。从NT和NTS组感官结果看，NT组微酸、有甜味，比NTS组（酸味刺鼻）要好，其他指标没有明显区别。而干物质含量对青贮饲料发酵过程具有重要指示作用^［11］，青贮100 d后，NT组干物质含量是38.33%，比NTS组（干物质含量42%）略低。表明NT组在青贮过程中，营养物质损失量比NTS组多3.67%。这可能与沙柳材料结构较致密，不利于利用其营养成分有关，这一结果与NT组中WSC和NH₃-N分别偏低和偏高相吻合。另外，蛋白质含量是饲料质量的一个很重要指标，而木质素则是作为抗营养因子成为衡量饲料质量好坏的另一个因素。实验组中NT组CP含量显著高于NTS组，这与柠条作为豆科灌木比沙柳蛋白质含量高直接相关；而木质素含量显著低于NTS组，表明沙柳的木质素含量比柠条高。综合感官评定、蛋白质和木质素含量等结果，添加沙柳对柠条青贮不一定能助力饲料品质的改善。

在青贮饲料中，有机酸的种类和含量是评价青贮发酵品质的重要因素^［12-13］。其中，乳酸是决定青贮能否成功的关键指标，也是青贮饲料后期良好储存的重要因素^［14］。乙酸含量较高可能是存在兼性乳酸菌或者异型乳酸菌所导致。丙酸可以抑制真菌的活性，使其进入休眠状态，还可降低二次发酵的可能性^［15］。丁酸是由不良杂菌产生的一种微量有机酸，与青贮饲料的腐败程度有关。其含量的高低代表着青贮料的品质^［16］，当丁酸含量较高时，说明青贮饲料腐败，青贮品质较低；反之，含量越低，饲料的适口性越好。而异丁酸浓度过高时，可能对乳酸菌等有益发酵菌群产生抑制作用，导致青贮发酵效率下降^［17］。在本研究结果中，除了异丁酸含量表现为NTS组（1 613 μg/mL）比NT组（113 μg/mL）显著高外，其余有机酸没有显著差异。NTS组中IBA含量较高可能是其感官中刺鼻直接体现。其来源与沙柳原料直接相关，可能与沙柳表面微生物菌群（如含有异丁酸菌等）或沙柳原料成分（如特殊或相关蛋白质等）有关。因此，从有机酸的角度也表明柠条单独青贮比柠条沙柳混合青贮效果要好。

3.2 两种方案中沙柳对青贮微生物多样性和丰度的影响

微生物群落是影响青贮饲料品质的一个关键因素^［18］，青贮饲料的质量与细菌群落组成密切相关^［19］。本研究发现在细菌门水平上NT组和NTS组主要菌门均为厚壁菌门，这与Mu等^［20］的研究结果类似，这种相似性的原因可能是参与青贮发酵的主要微生物属于厚壁菌门。变形菌门和蓝细菌门也占有一定地位，变形菌门和蓝细菌门的微生物都是革兰氏阴性菌，其外膜的通透性通常受pH值的影响^［21］。有研究表明，变形菌门在土壤中丰度较高^［22］，所以柠条样品中存在变形菌门可能是其自身生长过程中就已经携带的，且变形菌门能对土壤中的有害菌有拮抗作用^［23］。添加沙柳后明显增加了蓝细菌门的丰度，蓝细菌作为自养生物会消耗无机化合物以供自身生长^［24-25］。乳酸菌产生的乳酸会降低pH值，从而抑制变形菌门和蓝细菌门的生长^［26］。在属水平上，NT组的布氏乳杆菌属显著高于NTS组，乳杆菌属能够提高青贮饲料的有氧稳定性，对NT组的青贮起到改善作用。添加沙柳的NTS组，明串珠菌属和unidentified chloroplast大幅度增加，可能是沙柳表面附着微生物以这两种为优势菌；同时布氏乳杆菌属丰度值大幅度降低，可能是明串珠菌属和unidentified chloroplast与布氏乳杆菌属竞争营养所致，并最终由于明串珠菌属和unidentified chloroplast的代谢产物引起NTS组有刺鼻味。

在两种方案的青贮中，真菌中子囊菌门均占据优势地位，子囊菌门主要分解土壤中的有机物质，因此可能是柠条样品自身携带的。子囊菌门占据优势地位也说明了各组柠条样品含有丰富的有机物质，为其提供了良好的生长环境。担子菌门与子囊菌门皆是典型的腐生菌门，能够分解有机物质^［27］，在这两种方案中没有显著区别。而在属的水平上，NT组中每种真菌属丰度值都不高，处在1%~7%之间，在一定程度上受青贮环境中残留氧和过程中产生的酸的影响。而在NTS组中，Nothophoma、Knufia、Camarosporidiella丰度值相对较高，达到了67.3%。这三个真菌属均适宜在有氧条件下生存，丰度值偏高可能与NTS组中沙柳枝条结构（如中空、木质化等）材质以及毛乌素沙漠地域^［28］有关，致使NTS组中残留一定量的氧气或氧化还原电位相对较高。

4 结论

柠条单独（NT组）和柠条沙柳混合（NTS组）两种方案在添加蔗糖的前提下均能够顺利青贮。从青贮100 d的感官和品质方面比较，NT组优于NTS组。NT组青贮料清香，微酸，有甜味，无积水，黄绿色，CP和氨氮含量较高，木质素降解明显，戊酸、丁酸及异丁酸含量低。NTS比NT组的群落多样性丰富，丰度值结构也有变化，厚壁菌门和乳酸菌属下降，Cyanobacteria门、子囊菌门、明串球菌属和假茎点霉属（Nothophoma）显著上升。

因此，在未来的研究中，若添加既能降解纤维素和木质素，同时也能产酸的微生物，弥补柠条中WSC不足，柠条单独青贮极可能获得好的感官和品质。这为防风固沙的先锋灌木——柠条的次生产业链高质量发展提供借鉴和思考。

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基金资助

内蒙古自治区自然科学基金面上项目(2022MS03035)

鄂尔多斯市科技重大专项项目(2022EEDSKJZDZX017)