牛乳腺炎粪肠球菌逃逸巨噬细胞的分子机制研究

摘要

为研究牛乳腺炎粪肠球菌β溶血素cylA基因对牛单核巨噬细胞（BMC-7）吞噬功能和免疫调节的分子机制，利用牛乳腺炎粪肠球菌临床分离的野生型菌株（BME1708）及cylA基因缺失突变株（BME1708△cylA）对牛巨噬细胞进行侵染，利用MTT检测法检测细胞活性；在明确细胞活性不受影响的条件下，提取被侵染的BMC-7总mRNA，利用RT-qPCR检测细胞因子IL-4、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α以及NOS2的转录水平差异，采用ELISA法检测相应表达水平；利用Western blot检测牛乳腺炎粪肠球菌cylA基因对BMC-7的p38 MAPK信号通路磷酸化水平的影响；利用p38 MAPK信号通路抑制剂（PD 169316）孵育BMC-7,ELISA法检测相应细胞因子表达水平，以明确cylA基因调控该信号通路的分子机制。结果显示：与BME1708组相比，BME1708△cylA组在IL-10和TNF-α转录水平下调，IL-4、IL-8、IL-12以及NOS2转录水平上调，差异均具有统计学意义（P<0.05）；与BME1708组相比，BME1708△cylA组IL-10表达水平下调，IL-4、IL-8、IL-12表达水平上调，差异均具有统计学意义（P<0.05）;TNF-α的表达水平降低，但是差异不显著；对p38 MAPK磷酸化检测结果显示，粪肠球菌cylA基因可以激活p38 MAPK信号通路并使其磷酸化；在PD 169316孵育后，与未添加抑制剂组相比，添加抑制剂组的IL-10、TNF-α的表达水平下调，IL-4、IL-8、IL-12的表达水平上调，差异均具有统计学意义（P<0.05）。上述结果表明，p38 MAPK信号通路为粪肠球菌β溶血素cylA基因发挥免疫调节机制的重要通路，该结论为奶牛乳腺炎的治疗及防控提供新的靶位，可通过其毒力的钝化以及对p38 MAPK信号通路进行识别及信号通路封闭，对粪肠球菌感染进行有效防控。

关键词

牛乳腺炎 / 粪肠球菌 / 溶血素cylA基因 / 细胞因子 / p38 MAPK

基金资助

国家自然科学基金项目（32060798）; 内蒙古自治区科技计划项目（2021GG0001）; 内蒙古自治区自然科学基金项目（2021MS03084）