基于将mTET1-H6与MBD融合的新蛋白酶促体系的优化

摘要

TET（Ten-Eleven-Translocation）是依赖于Fe²⁺和α-酮戊二酸（α-KG）的双加氧酶，具有氧化5-甲基胞嘧啶（5mC）的能力。为了提高酶的催化效率，以小鼠TET1（mTET1）为研究对象，将甲基化CpG结合域（MBD）与mTET1进行融合，研究亚铁盐种类及浓度、小分子添加剂种类及浓度、缓冲液种类、酶浓度与不同种类、代数的聚酰胺-胺树状大分子对酶促反应的影响。结果表明，甲基化CpG结合域（MBD）的融合有利于结合底物DNA,从而提高mTET1-H6的酶活性。在100μL反应体系中，1 mmol/L的硫酸亚铁铵和Hepes-NaOH缓冲液有助于酶促反应，相对酶活分别提高2.04倍和3.88倍，且10μg的酶量有利于提高酶促反应速率。此外，在催化体系中添加1 mmol/L的L-半胱氨酸和四氯对苯醌小分子、40 nmol/L的第五代树状大分子可以进一步提高酶的氧化能力，相对酶活分别提高5.7倍、6.39倍和7.62倍。mTET1-H6-MBD对5mC迭代氧化为5hmC、5fC和5caC的转化率达78.66%。

关键词

mTET1蛋白 / 甲基化CpG结合域 / 酶促反应体系优化 / 聚酰胺-胺树状大分子

基金资助

科技部重大研发计划(2018YFA0801101)