托法替布通过JAK/STAT3通路抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化

摘要

目的：研究泛Janus激酶(Janus kinase, JAK)抑制剂托法替布(tofacitinib)对转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的作用及机制，为临床治疗结缔组织病相关的间质性肺疾病提供理论依据。方法：(1)体外培养人胚胎肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast 1, HFL-1),设立6个组，分别为DMSO空白对照组、TGF-β1诱导组、TGF-β1联合不同浓度托法替布(0.5、1.0、2.0、5.0μmol/L)药物干预实验组。采用CCK-8法检测细胞活力，划痕愈合实验检测细胞迁移能力。(2)采用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,RT-PCR)、蛋白免疫印迹实验(Western blotting)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,COL1)基因及蛋白的表达水平。应用RT-PCR和酶联免疫吸附试验检测各组白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的基因和细胞培养上清液中的蛋白水平。(3)在不同组的细胞培养基中加入DMSO载体对照，以1.0μmol/L和5.0μmol/L的托法替布预培养30 min,然后加入TGF-β1处理1 h、6 h和24 h。以Western blotting检测Smad2/3、信号传导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的蛋白磷酸化水平。结果：(1)托法替布抑制TGF-β1诱导的HFL-1细胞活力及迁移能力。(2)与空白对照组相比，TGF-β1诱导组HFL-1的α-SMA、COL1A1和FN1基因表达显著上调(P<0.05)。5.0μmol/L托法替布干预组的α-SMA基因表达与TGF-β1诱导组相比显著下调(P<0.05)。0.5～5.0μmol/L托法替布各干预组与TGF-β1诱导组相比均可抑制FN1基因表达(P<0.05)。各干预组与TGF-β1诱导组相比，COL1A1基因的表达无明显变化。(3)Western blotting结果提示，TGF-β1诱导组细胞α-SMA、FN1蛋白水平较对照组显著增加(P<0.05),COL1A1表达未见明显差异。托法替布不同浓度干预组与TGF-β1诱导组相比，α-SMA蛋白表达均有下降，其中2.0μmol/L和5.0μmol/L干预组与诱导组间的差异有统计学意义(P<0.05)。托法替布不同浓度干预组的FN1蛋白水平均有下降，但与TGF-β1诱导组相比差异无统计学意义。各干预组的COL1A1蛋白表达与TGF-β1诱导组相比差异无统计学意义。(4)TGF-β1诱导48 h, HFL-1细胞中IL-6基因及培养上清液中IL-6的表达水平较对照组显著升高，各浓度托法替布干预组与TGF-β1诱导组相比均有所降低。TGF-β1诱导1 h、6 h和24 h, STAT3蛋白磷酸化水平增加，托法替布预刺激抑制了6 h时Smad2/3的磷酸化水平，在1 h、6 h和24 h时均抑制了STAT3的磷酸化水平。结论：托法替布能抑制TGF-β1诱导的HFL-1细胞向肌成纤维细胞方向转化，其机制可能是通过抑制Smad2/3经典通路以及抑制TGF-β1所诱导的STAT3磷酸化，从而对肺纤维化疾病进展发挥保护作用。

关键词

托法替布 / 肺纤维化 / 成纤维细胞 / 肌成纤维细胞 / STAT3转录因子