siRNA沉默NLK基因促进神经化组织工程骨再生

李梦迪; 雷蕾; 刘中宁; 李健; 姜婷

doi:10.19723/j.issn.1671-167X.2025.02.002

北京大学学报（医学版） ›› 2025, Vol. 57 ›› Issue (02) : 227 -236. DOI: 10.19723/j.issn.1671-167X.2025.02.002

siRNA沉默NLK基因促进神经化组织工程骨再生

李梦迪, 雷蕾, 刘中宁, 李健, 姜婷

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摘要

目的：探讨沉默及过表达Nemo样激酶(Nemo-like kinase,NLK)基因对人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hBMSCs)神经向分化的作用，并探究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默NLK基因表达对促进神经化组织工程骨再生的影响。方法：在hBMSCs中分别转染siRNA沉默NLK基因(实验组转染沉默NLK基因的siRNA,对照组转染对照siRNA并记为阴性对照组)或慢病毒过表达NLK基因(实验组感染过表达NLK基因的慢病毒，对照组感染空载体慢病毒并记为空载体组),之后通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)、蛋白质印迹实验(Western blot)、免疫荧光实验检测敲低、过表达NLK基因对hBMSCs神经向分化的影响。采用6周龄雄性BALB/C nu/nu裸鼠构建皮下异位成骨模型，分为以下4组：(1) β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate, β-TCP)组，(2) β-TCP+hBMSCs成骨诱导组，(3) β-TCP+siRNA-阴性对照(negative control, NC)转染的hBMSCs成骨诱导组，(4) β-TCP+siRNA-NLK转染的hBMSCs成骨诱导组。术后4周获取标本，通过组织形态学染色检测裸鼠体内成骨成神经情况，使用独立样本t检验进行统计学分析。结果：siRNA沉默hBMSCs的NLK基因后，神经相关基因βⅢ微管蛋白(classⅢβ-tubulin,TUBB3)、微管相关蛋白2(microtubule association protein-2,MAP2)、可溶性蛋白-100(soluble protein-100,S100)、巢蛋白(nestin,NES)、NG2蛋白聚糖(NG2 proteoglycan,NG2)及降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)表达较阴性对照组显著升高(P<0.05), TUBB3、MAP2等蛋白表达也升高。慢病毒过表达NLK基因后，与空载体组相比，神经相关基因TUBB3、MAP2、S100及NG2表达水平均显著下降(P<0.05), TUBB3蛋白表达降低。构建裸鼠皮下异位成骨模型术后4周发现β-TCP+siRNA-NLK转染的hBMSCs成骨诱导组较其他3组形成更多矿化组织，并且成骨相关标记物BMP2及成神经相关标记物S100显著高表达。结论：siRNA沉默NLK基因可以促进hBMSCs体外神经向分化，并在裸鼠体内异位成骨模型中能够促进神经化组织工程骨的形成。