泛素特异性蛋白酶35对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞铁死亡的作用及机制

摘要

目的：研究泛素特异性蛋白酶35（ubiquitin-specific protease 35, USP35）对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis-fibroblast like synoviocytes, RA-FLS）铁死亡的作用及机制，加深对RA发病机制的理解，并为其治疗提供潜在的标靶。方法：（1）体外培养RA-FLS,用慢病毒载体感染以构建稳定敲低USP35的细胞系（short hairpin ribonucleic acid of USP35, shUSP35）和其对照细胞系（negtive control of short hairpin ribonucleic acid, shNC）,以及稳定过表达USP35的细胞系（overexpression of USP35,USP35 OE）和其对照细胞系（Vector）。为了探究USP35在铁死亡调控中的作用，使用1μmol/L依拉司亭（Erastin）诱导RA-FLS细胞构建铁死亡模型。将细胞分为6组，第一组是shNC细胞，第二组是用Erastin处理shNC细胞（shNC+Erastin）,第三组是用Erastin处理shUSP35细胞（shUSP35+Erastin）,第四组是Vector细胞，第五组是用Erastin处理Vector细胞（Vector+Erastin）,第六组是用Erastin处理USP35 OE细胞（USP35 OE+Erastin）。（2）采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8, CCK8）检测细胞活力；（3）分别使用活性氧（reactive oxygen species, ROS）检测试剂盒、丙二醛（malondialdehyde, MDA）检测试剂盒、谷胱甘肽（glutathione, GSH）和氧化型谷胱甘肽（glutathione sulfide, GSSG）检测试剂盒、亚铁离子含量检测试剂盒检测细胞中ROS、MDA、Fe²⁺的含量以及GSH/GSSG比值；（4）采用蛋白免疫印迹实验（Western blotting）检测溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11,SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）蛋白的表达水平。结果：（1）与shNC+Erastin组相比，shUSP35+Erastin组的RA-FLS细胞活力显著降低（P<0.001）,而与Vector+Erastin组相比，USP35 OE+Erastin组的细胞活力显著升高（P<0.001）,表明USP35可显著缓解Erastin对RA-FLS细胞活力的抑制作用。（2）与shNC+Erastin组相比，shUSP35+Erastin组细胞的ROS（P<0.001）、 MDA（P<0.05）和Fe²⁺水平（P<0.001）显著升高，GSH/GSSG比值显著增加（P<0.05）;而与Vector+Erastin组相比，USP35OE+Erastin组细胞的ROS（P<0.001）、MDA（P<0.05）和Fe²⁺水平（P<0.05）显著降低，GSH/GSSG比值显著下降（P<0.05）,表明USP35可显著抑制Erastin诱导的RA-FLS细胞氧化应激和脂质过氧化。（3）在Erastin诱导的RA-FLS中，USP35的表达与SLC7A11和GPX4蛋白水平呈正相关。结论：USP35抑制RA-FLS的铁死亡，可能与增加SLC7A11和GPX4表达相关。

关键词

泛素特异性蛋白酶35 / 类风湿关节炎 / 铁死亡 / 溶质载体家族7成员11 / 谷胱甘肽过氧化物酶4