肿瘤转移抑制基因LASS2去磷酸化对液泡型ATP酶活性及前列腺癌侵袭性的影响

摘要

目的：探讨人源酵母LAG1长寿同源物2（homo sapiens longevity assurance homolog 2 of yeast LAG1,LASS2）去磷酸化对前列腺癌细胞生物学功能的影响及其分子机制。方法：对90例前列腺癌患者的石蜡组织芯片标本进行LASS2免疫组织化学染色，并构建FLAG标签的LASS2全长pcDNA3真核表达载体，转染至HEK 293T细胞后行免疫共沉淀和蛋白质谱检测，分析LASS2的磷酸化位点。根据LASS2磷酸化位点结果构建LASS2 C末端5个去磷酸化突变体的pcDNA3真核表达载体，并稳定转染到高转移潜能前列腺癌PC-3M-1E8细胞系中，通过生长曲线、MTT掺入实验、平板克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验和流式细胞术检测LASS2及其去磷酸化突变体对前列腺癌细胞生物学功能的影响。检测LASS2及其突变体对液泡型ATP酶V0复合体中c亚基（ATP6V0C）表达量及两者相互结合的影响，以及其对液泡型ATP酶活性、细胞外H⁺浓度和基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP-2）活性的影响，并探索蛋白磷酸酶抑制剂calyculin A对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果：免疫组织化学染色显示前列腺癌组织中LASS2的表达与Gleason分级呈负相关；质谱分析发现LASS2的C末端存在3个磷酸化位点（Ser-341、Ser-348和Ser-349）;与野生型LASS2相比，LASS2 S348位点的去磷酸化突变体（LASS2-S348A）能显著增强前列腺癌细胞的增殖能力、锚着不依赖生长能力、细胞迁移能力（细胞迁移率从49.11%±5.62%增加到74.28%±8.77%,P<0.001）和侵袭能力（穿膜细胞数从129.67±13.65增加到206.67±13.50,P<0.001）,并显著降低S期比例（从44.17%降低到37.90%,P<0.05）和细胞凋亡率（从48.540%±0.269%降低到29.700%±0.778%,P<0.05）。LASS2-S348A去磷酸化突变体虽然不影响ATP6V0C的蛋白表达量，但会明显抑制LASS2与ATP6V0C的结合能力，并进而显著增强液泡型ATP酶活性和细胞外H⁺浓度，最终促进MMP-2的活性；而蛋白磷酸酶抑制剂calyculin A能够显著抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。结论：LASS2蛋白C末端S348位点的磷酸化对于LASS2的肿瘤抑制功能至关重要，其分子机制可能是LASS2 S348位点的磷酸化通过增强其与ATP6V0C的结合而抑制液泡型ATP酶活性，进而降低细胞外H⁺浓度和抑制MMP-2的活性，并最终抑制前列腺癌细胞的侵袭；蛋白磷酸酶抑制剂calyculin A有望成为侵袭性前列腺癌潜在的治疗药物。

关键词

前列腺肿瘤 / 肿瘤浸润 / 基因表达调控,肿瘤 / 空泡质子转运ATP酶 / LASS2基因