细胞膜囊泡递送靶向肿瘤坏死因子-α的小干扰RNA对牙髓干细胞的抗炎作用

摘要

目的：探索细胞膜囊泡(cell membrane vesicles, CMVs)作为广泛适用的基因沉默工具小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)递送平台的可行性，并以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的人牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)炎症模型验证其应用效果。方法：采用细胞松弛素B处理3T3细胞制备CMVs,并通过共聚焦显微镜、动态光散射检测CMVs理化性质。利用洋地黄皂苷透化CMVs将靶向肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的siRNA(siTNF-α)负载至CMVs中，构建CMVs@siTNF-α。通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测siRNA负载与胞内转运效率。以LPS(1 mg/L)刺激DPSCs建立炎症模型，并与CMVs或CMVs@siTNF-α共培养。采用细胞活力检测试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)检测细胞毒性，实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测TNF-α、白介素(interleukin, IL)-1β和IL-6的表达与分泌。结果：CMVs呈球形，由细胞膜及细胞质构成，平均粒径为903 nm,表面电位为-9.39 mV。流式细胞术结果显示，负载荧光素酰胺(fluorescein amidite, FAM)标记siRNA(FAM-siRNA)后CMVs荧光强度升高；DPSCs加入CMVs@FAM-siTNF-α培养24 h后，荧光信号增强。CCK-8检测结果显示CMVs及CMVs@siTNF-α对DPSCs无明显毒性。LPS处理显著上调DPSCs中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，与LPS组相比，CMVs@siTNF-α下调TNF-α mRNA及其蛋白表达水平，并抑制IL-1β和IL-6的转录与分泌。单独CMVs处理无明显差异。结论：CMVs可作为一种低毒性的siRNA递送平台，在体外炎症模型中实现TNF-α沉默及下游炎症反应抑制，具有进一步研究和应用的潜力。

关键词

小干扰RNA / 细胞膜囊泡 / 牙髓干细胞 / 肿瘤坏死因子