饲料中大豆异黄酮检测方法的建立

Establishment of a method for detecting the soy isoflavones in feeds

摘要

目的 建立用于检测饲料中大豆提取物的高效液相色谱方法（HPLC），为大豆异黄酮在畜牧业的合理使用提供支持。 方法 通过查阅文献，采用HPLC色谱技术，样品经甲醇溶液超声提取后，以乙腈-0.1%醋酸水为流动相梯度洗脱，260 nm波长检测。 结果 建立的HPLC检测方法，线性范围为0.2~20 μg/mL，定量限可达0.197 μg/mL，以2、15 μg/mL的质量浓度进行添加回收，添加回收率为97.45%~102.54%。 结论 按建立的HPLC方法检测5%纯度的大豆异黄酮，可检测6种组分的含量分别为：大豆苷1.13%、大豆黄苷0.22%、染料木苷2.79%、大豆苷元0.55%、大豆黄素0.06%和染料木素0.29%，总黄酮含量为5.04%。

关键词

大豆异黄酮 / HPLC / 大豆提取物 / 检测 / 饲料

Key words

soy isoflavones / high-performance liquid chromatography (HPLC) / soy extracts / detection / feeds

大豆异黄酮（soy isoflavones，SI）是豆科植物的次生代谢产物，为黄酮类物质，其母核为3-苯并吡喃酮，主要包括大豆苷、大豆黄苷、染料木苷及其相应苷元。其结构类似于雌激素，具有双向雌激素作用，即类雌激素作用和抗雌激素作用。大豆异黄酮可增强动物免疫力、提高繁殖性能，促进动物生长，其作为饲料添加剂有剂量小、见效较快等特点，具有广阔应用前景^[1-3]。但是由于其抗雌激素作用，临床上使用时应注意饲料组成、添加时机、添加剂量和持续时间，避免不良反应的发生。因此，有必要建立高效快捷的检测方法，为大豆异黄酮在畜牧业的合理使用提供支持。目前，尚未见饲料大豆提取物中6种物质的检测方法。本研究旨在建立高效液相色谱方法（HPLC），用于检测饲料中的大豆异黄酮，该方法可同时测定大豆苷、大豆苷元、大豆黄苷、染料木苷、大豆黄素和染料木素的含量。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）标准品：大豆苷、大豆苷元（大豆黄酮）、大豆黄苷，染料木苷、大豆黄素，染料木素等标准品，均购自中科质标所。

2）高效液相色谱仪带二极管矩阵检测器。岛津；色谱柱C18，长250 mm，内径4.6 mm，粒度5 µm。

3）5%纯度的大豆异黄酮，由成都蓓乐康生物技术有限公司馈赠。

4）分析天平。梅特勒公司。

1.2 试验方法

1）标准溶液制备。精密称取大豆苷、大豆苷元、大豆黄苷、染料木苷、大豆黄素、染料木素对照品适量，置于容量瓶中，加甲醇（AR）溶液超声溶解5 min，制成每1 mL溶液含0.1 mg/mL过0.45 μm微孔滤膜过滤。

2）样品前处理方法。精密称取大豆异黄酮提取物20 mg置于50 mL容量瓶中，加入甲醇（AR）溶液超声溶解5 min，冷却至常温，定容至50 mL，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜过滤。

3）流动相制备。以乙腈与0.1%醋酸水为流动相，取乙腈与0.1%醋酸水过0.45 μm微孔滤膜，超声脱气20 min后，冷却至室温备用。

4）色谱条件。色谱柱C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；波长：260 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；溶剂：乙腈与0.1%醋酸水梯度洗脱，洗脱程序见表1。

5）测定。取提取溶液10 μL注入液相色谱中，记录各个峰的峰面积，然后按外标法进行计算。

各组分含量= \frac{\mathrm{样品}\mathrm{峰面}\mathrm{积}\times \mathrm{对照}\mathrm{品浓}\mathrm{度}\times \mathrm{样品}\mathrm{体积}}{\mathrm{对照}\mathrm{品峰}\mathrm{面积}\times \mathrm{样品}\mathrm{重量}} \times \mathrm{100} \mathrm{\%}

6）标准曲线的绘制。精密称量大豆异黄酮标准品适量，使其质量浓度介于0.2~20.0 μg/mL，取5个浓度值。各取10 μL进样，HPLC检测。每一浓度进样3次，取平均值。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求出回归曲线和相关系数。

7）检测限和定量限的测定。取10个空白样品，按“1.2”中2）方法处理，测得基线噪音值，按信噪比为3~10计算方法检测限和定量限。

8）添加回收率。分别以质量浓度2、15 μg/mL测定添加回收率，按“1.2”中2）方法检测5%纯度的大豆异黄酮。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

取上述浓度配制的大豆异黄酮标准溶液，在选定的色谱条件下进行测定，色谱峰面积和浓度呈线性相关，各组分标准曲线见表2，标准色谱图见图2。由表2可知，建立的HPLC方法，R²介于0.992~0.999，线性范围良好。从图1可以看出，6种物质均可分离，从而佐证建立的大豆异黄酮HPLC方法可进行检测分析。

2.2 检测限和定量限

根据空白样品的基线噪音值，求其平均值，以大约3倍信噪比计算检测限，以大约10倍信噪比计算定量限，经计算所得检测限和定量限见表3。大豆异黄酮各组分的定量限介于0.197 0~0.238 5 μg/mL。饲料中大豆异黄酮的添加量范围一般为30~200 mg/kg，本方法的定量限可满足检测需求。

2.3 添加回收率的测定

分别以2、15 μg/mL的质量浓度进行添加回收试验，检测结果见表4。由表4可知，添加回收率介于97.45%~102.54%。

2.4 5%纯度大豆异黄酮的检测

按建立的HPLC方法检测5%纯度的大豆异黄酮，可检测6种组分的含量分别为：大豆苷1.13%、大豆黄苷0.22%、染料木苷2.79%、大豆苷元0.55%、大豆黄素0.06%和染料木素0.29%，总黄酮含量为5.04%。

3 讨论

大豆黄酮具有调节激素水平、促进生殖系统发育、提高泌乳能力、提高免疫力、强化骨骼等多重作用，在猪和蛋禽饲养方面，可提升动物的生产性能指标，获得增值效益。卢建等^[1]研究结果发现，在如皋黄蛋鸡日粮中添加50、100、200 mg/kg的大豆黄酮，可以提高受精蛋孵化率和入孵蛋孵化率。邵丹等^[2]研究发现，30、60 mg/kg大豆黄酮可显著提升产蛋后期海兰褐蛋种鸡的产蛋率和产蛋量。肖蕴祺等^[3]研究表明，大豆黄酮组的产蛋率提高了11.67%（P＜0.05），料蛋比降低了8.1%（P＜0.05），大豆黄酮组的哈氏单位提高了7.7%（P＜0.05）。张玲等^[4]研究表明，饲粮中添加30 g/t大豆异黄酮，可提高乌骨鸡11.67%的产蛋率，降低8.1%的料蛋比，在产蛋后期添加大豆异黄酮，可改善蛋鸡生产性能和蛋品质。上述研究表明，添加不同浓度的大豆异黄酮，对畜禽的生产性能影响不一，原因在于大豆异黄酮的双向雌激素作用。

由于SI中含有多个组分，因而其方法一般为多组分分析方法。胡莉等^[5]2017年建立的HPLC方法，可测定粮食中6种大豆异黄酮（大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素）。杨子秋等^[6]2018年建立了HPLC法测定保健食品中4种大豆异黄酮的含量：大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素的平均回收率分别为101.61%、100.11%、101.95%、101.21%。马翛然等^[7]2018年建立了可同时测定大豆和大豆制品中黄豆黄素、黄豆黄苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鸢尾黄酮苷和鹰嘴豆芽素A共8种异黄酮含量的HPLC方法。本方法以甲醇水溶液提取异黄酮，经C18固相萃取柱净化，梯度洗脱，加标回收率为79.3%~102.5%。吴俊发等^[8]2021年建立超高效液相色谱法（UPLC）同时测定保健品中大豆苷、染料木苷、染料木素和大豆素4种大豆异黄酮的分析方法。

上述研究，均采用HPLC反向色谱技术，检测波长介于250~260 nm，采用梯度洗脱程序。提取溶液多选择80%~90%甲醇水溶液，但是杨子秋等^[6]研究表明80%的甲醇水溶液提取效果最差，究其原因可能为样品来源不同。色谱技术对不同基质的样品有不同的提取净化要求，如果基质简单，可直接使用有机溶剂进行处理，但是基质复杂或者组分含量偏低，就需要采用相适应的净化富集技术，如马翛然等^[7]研究中有发酵类产品，故采取了C18固相萃取技术。饲料中的基质相对简单，本研究中，虽然大豆提取物中6种组分的含量不一，但可以直接采用甲醇进行提取，结合文献资料，本研究建立了可检测饲料中大豆异黄酮含量的HPLC方法，方法的检测限可达0.2 μg/mL，可用于检测饲料中大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、大豆黄素和染料木素等6种组分。

参考文献

[1] 卢建， 王克华， 曲亮， 大豆黄酮对45~58周龄如皋黄鸡蛋鸡生产性能、繁殖器官发育和种蛋孵化率的影响[J]. 动物营养学报， 2014，26（11）：3420-3425.

[2] 邵丹， 胡艳， 王强， 大豆黄酮对产蛋后期蛋种鸡生产性能、激素水平和繁殖性能的影响[J]. 中国家禽， 2016，38（20）：28-31.

[3] 肖蕴祺， 王强， 童海兵， 大豆黄酮对产蛋后期地方蛋鸡生产性能、蛋品质和血浆激素指标的影响[J]. 动物营养学报， 2018，30（3）：1110-1115.

[4] 张玲， 钟光， 张尧， 大豆黄酮对余干乌骨鸡产蛋后期产蛋性能和蛋品质的影响[J]. 中国家禽， 2020，42（4）：63-66.

[5] 胡莉， 靳可婷， 仲伶俐， 高效液相色谱法同时测定粮食中6种大豆异黄酮[J]. 食品安全质量检测学报， 2017（11）：4368-4373.

[6] 杨子秋， 苏小军. HPLC法测定保健食品中四种大豆异黄酮的含量[J]. 食品安全导刊， 2018（9）：119-121.

[7] 马翛然， 张洛莎， 王鹏， 固相萃取-反相高效液相色谱测定食品中大豆异黄酮含量的方法[J]. 中国酿造， 2018，37（11）：147-153.

[8] 吴俊发， 谭健辉， 马鑫. 超高效液相色谱法同时测定保健品中4种大豆异黄酮[J]. 食品安全质量检测学报， 2021（6）：2264-2268.