大豆低聚肽对嗜酸乳杆菌的增殖效果研究

Effects of soybean oligopeptides on the proliferation of Lactobacillus acidophilus

摘要

目的 探究大豆低聚肽对嗜酸乳杆菌生长的影响，为乳酸菌体内定植提供思路。 方法 试验组加入不同质量浓度的大豆低聚肽于MRS肉汤培养基中，培养嗜酸乳杆菌48 h测定OD_{600 nm}；测定不同培养时间下嗜酸乳杆菌培养液的OD_{600 nm}，绘制生长曲线；以300、600、1 200 mg/kg剂量的大豆低聚肽-嗜酸乳杆菌菌悬液连续灌胃抗生素诱导的肠道菌群紊乱小鼠7 d，测定大豆低聚肽作用下小鼠体质量变化。 结果 40、30、20 mg/mL大豆低聚肽能明显增加嗜酸乳杆菌菌液浊度，促进嗜酸乳杆菌增殖；能使嗜酸乳杆菌培养12 h后进入对数生长期，提前进入快速增长状态并提高增长速度；低剂量组（300 mg/kg）、中剂量组（600 mg/kg）、高剂量组（1 200 mg/kg）均能促进小鼠体质量增长，且600 mg/kg中剂量组体质量增加2.89 g，与阴性对照组差异显著。 结论 大豆低聚肽在体外能明显促进嗜酸乳杆菌增殖，添加的大豆低聚肽质量浓度为40 mg/mL时增殖效果最为显著。能促进小鼠体质量增长，但其促进乳酸菌的体内定植机制需要进一步评价。

关键词

大豆低聚肽 / 嗜酸乳杆菌 / 体外增殖 / 体内定植 / 肠道营养

Key words

soybean oligopeptides / Lactobacillus acidophilus / proliferation in vitro / colonization in vivo / intestinal health

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）指利用可发酵碳水化合物、分解消化牛奶中的乳糖而生产乳酸的一类细菌，广泛存在于人体肠道中，可用于治疗腹泻、抗肿瘤、增强机体免疫力和降血压、血脂等^[1]。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）是乳酸菌的一种，耐酸和抗逆性强，能在其他乳酸菌不能生长的环境中生长繁殖，调节肠道菌群平衡，是肠道内重要的益生菌^[2-3]。研究证实^[4-6]，嗜酸乳杆菌调节肠道菌群平衡生理功能的实现，与其能否在肠道中黏附、定植有着极大的关系，能否黏附定植在肠上皮细胞成为菌种筛选的先决条件。

大豆低聚肽是以大豆蛋白为原料开发的活性肽，具有抗氧化、抗疲劳、降血脂、降血压等作用，被广泛应用于食品行业特别是保健食品、运动员食品和功能性饮料。以往研究表明，大豆低聚肽具有促进微生物生长繁殖、活跃代谢、调节肠道的作用^[7]，能够促进乳酸菌的增殖，抑制有害菌如大肠杆菌的生长^[8-9]。目前，关于大豆低聚肽的研究主要集中于抗氧化、抗疲劳以及降血脂、降血压等方面^[10-12]，关于调节肠道微生态的研究报道较少。

为进一步探究大豆低聚肽对嗜酸乳杆菌的作用机制，本试验采用体内外双向验证方法，在体外研究不同浓度的大豆低聚肽对嗜酸乳杆菌的作用，同时对小鼠灌胃不同浓度大豆低聚肽-嗜酸乳杆菌菌悬液，体内研究大豆低聚肽对小鼠体质量的影响，旨在为大豆低聚肽用于促进嗜酸乳杆菌定植肠道提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

大豆低聚肽，购自上海源叶生物科技有限公司；MRS液体培养基，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 实验动物

BALB/c雄性小鼠42只，体质量18 g，购自斯被福（北京）生物技术有限公司。

1.3 试验菌种及活化

嗜酸乳杆菌：购自上海复祥生物科技有限公司。将嗜酸乳杆菌接种于M17固体培养基上，于37 ℃恒温培养箱培养48 h，挑单菌落于MRS液体培养基中，37 ℃培养48 h作为种子液，保存备用。

1.4 大豆低聚肽作用下嗜酸乳杆菌菌液吸光度测定

嗜酸乳杆菌36~48 h培养液稀释100倍，备用；以MRS液体培养基作为培养液，共设7个试验组，其中5个添加组加入大豆低聚肽50 µL使其最终质量浓度分别为40、30、20、2、0.2、0.02 mg/mL，加入140 µL MRS液体培养基，同时设置阴性对照组（不添加大豆低聚肽）和空白对照组（培养基），最后接种稀释菌液10 µL（空白对照组除外），于37 ℃培养箱培养48 h，测培养液OD_{600 nm}。培养液浓度越高，OD_{600 nm}值越大，代表嗜酸乳杆菌增殖越快。每个试验重复3次。

1.5 嗜酸乳杆菌生长曲线绘制

共设4个试验组，其中3个添加组于4 mL培养管中加入1 mL大豆低聚肽，加入MRS液体培养基，接种稀释菌液20 µL使大豆低聚肽最终质量浓度为40、30、20 mg/mL，阴性对照组不添加大豆低聚肽。在37 ℃培养箱中分别培养0、2、4、6、9、12、24、30、36、48 h时取200 µL培养液测定OD_{600 nm}，绘制不同浓度大豆低聚肽作用下嗜酸乳杆菌的生长曲线。

1.6 大豆低聚肽作用下小鼠体质量变化

42只雄性小鼠于实验室适应性饲养5 d后，分为6组，每组7只，分别为高剂量组（1 200 mg/kg）、中剂量组（600 mg/kg）、低剂量组（300 mg/kg）、阴性对照组、模型组、正常组。

除正常组外其余小组小鼠以0.2 mL的剂量灌胃125 mg/mL的头孢曲松钠4 d，每天2次，扰乱小鼠肠内菌群，正常组灌胃相同剂量生理盐水。4 d后，按照0.2 mL/10 g的剂量灌胃高、中、低剂量大豆低聚肽菌悬液，阴性对照组灌胃菌悬液，菌悬液浓度为1×10⁸ CFU/mL。模型组和正常组灌胃相同剂量的生理盐水，连续7 d，期间记录小鼠体质量变化。

1.7 数据统计分析

试验数据采用SPSS软件中单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同浓度大豆低聚肽对嗜酸乳杆菌菌液OD_{600 nm}的影响

由表1可知，在相同培养条件下，大豆低聚肽能增加嗜酸乳杆菌的菌液浊度，且随着质量浓度变化，OD_{600 nm}值随之降低。与阴性对照组相比，40、30、20、2 mg/mL试验组均有显著性差异（P<0.05），且40、30、20 mg/mL 3组与阴性对照组相比差异极显著（P<0.01），结果表明这3个质量浓度的大豆低聚肽能明显增加嗜酸乳杆菌菌液浊度。

2.2 不同浓度大豆低聚肽对嗜酸乳杆菌生长曲线的影响

由图1可知，添加不同浓度的大豆低聚肽的培养液OD_{600 nm}值均有不同程度的增加，且质量浓度越高，OD_{600 nm}值增加越多，其中40 mg/mL组增加最显著。添加不同浓度大豆低聚肽的试验组在培养12 h后进入对数生长期，而阴性对照组则在24 h后进入对数生长期，且之后添加组的菌液浊度明显高于阴性对照组，结果表明大豆低聚肽能使嗜酸乳杆菌提前进入快速增长状态并提高增长速度。

2.3 不同浓度大豆低聚肽对小鼠体质量的影响

由表2可知，雄性小鼠灌胃7 d后，所有处理组的小鼠体质量均有增长，1 200 mg/mL高剂量组和600 mg/mL中剂量组体质量分别增加2.34、2.89 g，变化大于阴性对照组（增长2.14 g），600 mg/mL中剂量组体质量变化差异显著（P<0.05），300 mg/mL低剂量组体质量增加0.87 g，变化小于阴性对照。结果表明高、中剂量的大豆低聚肽有调节肠道稳态、促进小鼠体质量增长的作用，分析其作用机制可能是大豆低聚肽促进了嗜酸乳杆菌在肠道的定植，调节菌群紊乱，促进肠道对食物的消化及吸收。

3 讨论

本试验针对大豆低聚肽对嗜酸乳杆菌的增殖作用进行体外试验，在MRS液体培养液中添加一定量的大豆低聚肽培养嗜酸乳杆菌48 h，随着大豆低聚肽质量浓度的增加，菌液的浊度也随之增加；在大豆低聚肽的作用下，嗜酸乳杆菌的生长曲线提前进入对数生长期，生长速度加快。试验结果说明大豆低聚肽对嗜酸乳杆菌的体外增殖有明显的促进作用，大豆低聚肽可作为氮源丰富嗜酸乳杆菌的氨基酸代谢途径，促进嗜酸乳杆菌的生长代谢。同时，大豆低聚肽为小分子肽，分子质量低，而嗜酸乳杆菌更易于运输小分子肽作为生长的营养物质，使其生长代谢得到增强。对肠道菌群失衡小鼠灌胃大豆低聚肽-嗜酸乳杆菌菌悬液，其中高剂量组和中剂量组小鼠体质量变化大于仅灌胃菌悬液的阴性对照组。试验结果说明大豆低聚肽能够促进乳酸菌在肠道的定植，使肠道乳酸菌数目增加。李世成等^{[9, 13]}研究证实，大豆低聚肽能以其特定的生物活性，刺激小肠黏膜组织结构形态的改变和保护肠道黏膜屏障，调节肠道微生态系统。

综上，大豆低聚肽在体外能明显促进嗜酸乳杆菌增殖，添加大豆低聚肽质量浓度为40 mg/mL时增殖的效果最为显著。大豆低聚肽能改善模型小鼠肠道菌群失衡，促进体质量增长，但是其促进乳酸菌的体内定植机制需要进一步评价。

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