益生菌对采食玉米赤霉烯酮污染日粮的育肥母猪的影响

Effects of probiotics on fattening sows fed with a diet contaminated with zearalenone

摘要

目的 研究微生物脱毒法对采食玉米赤霉烯酮(ZEA)污染日粮育肥母猪的治疗效果，为益生菌缓解育肥母猪ZEA中毒症状提供参考。 方法 选取体质量（36.17±2.24）kg育肥母猪18头,随机分为3个处理,对照组A按照标准饲料饲喂，处理组B在A组饲料基础上添加ZEA 300 µg/kg，处理组C在B组饲料基础上添加0.2%的自制益生菌（地衣芽孢杆菌和角蛋白酶）。每个处理组重复6次,试验期24 d。饲养试验完成后，根据母猪的生长性能和阴户面积等指标，从3个处理组中分别选取3头母猪进行屠宰检测。 结果 日粮中含有300.00 μg/kg的ZEA致使育肥母猪出现阴户肿胀，生殖器官指数增加。3组母猪外阴随饲养时间延长而红肿增大，但C组阴户面积可恢复至正常组水平。在日增质量、采食量、饲料转化率上表现大致相同。肝脏中没有检测到ZEA的残留。血清指标中各组FSH、LH、E2差异不显著，但B组血清中PRL与其他组差值较大。 结论 添加0.2%自制益生菌可以在体外降解ZEA，缓解母猪的外阴红肿现象，并减轻ZEA对动物的危害。

关键词

益生菌 / 玉米赤霉烯酮 / 育肥母猪 / 生物毒性 / 微生物法脱毒 / 地衣芽孢杆菌 / 角蛋白酶

Key words

probiotics / zearalenone / commercially fattening sows / biological toxicity / microbial detoxification / Bacillus licheniformis / keratase

玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）是一种有毒的真菌次级代谢产物。污染动物饲料的霉菌毒素可对动物产生毒性作用，并转移到动物产品中，危害动物与人类健康^[1]。科研机构在全国范围内所采集的840余份饲料原料和饲料样品经检测发现,我国的饲料原料和饲料均受到不同程度的污染^[2]。根据Holanda等报告，美国每年因为动物摄入饲料被ZEA污染而导致农业亏损将近数十亿美元^[3]。ZEA严重损害动物的肝功能和结构^[4]，对小肠的发育和吸收能力造成不利影响^[5]，破坏大肠的防御机制^[6]和污染盲肠微生物群^[7]。由于ZEA具有雌激素的作用，临床表现为雌激素过多，导致母猪外阴发红、充血和水肿，子宫增大，卵巢上形成囊肿和乳腺增大^[8]。

ZEA的脱毒方法主要包括物理、化学和微生物脱毒方法。物理法、化学法仪器设施花费较大，必须考虑营养元素损失、药物残留和消化性降低等因素^[9]。微生物法因具有高度特异性、有效性以及代谢产物无毒性的优点，在ZEA脱毒中具有较大的应用潜力^[10]。雷元培^[11]筛选的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ANSB01G对ZEA降解率高达88.65%，较好地减轻了ZEA对青年母猪的危害。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)和角蛋白酶组合的益生菌，被动物采食后，在动物的胃肠道内产生淀粉酶，可以促进饲料中营养物质的消化吸收；同时，它所分泌的酶类对霉菌毒素具有较好的降解作用^[12]。但益生菌对缓解育肥母猪ZEA中毒症状是否有效果目前还不清楚，为进一步明确益生菌在动物生产中的实际应用效果，本文采用自制的益生菌添加于饲料基础配方中，对比分析不同试验组育肥母猪的生产性能、血清学指标和肝脏中残留ZEA量，研究微生物脱毒方法的实际应用效果，为扩大益生菌的应用及饲料ZEA污染的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验用菌种

自制益生菌（地衣芽孢杆菌≥2.0×10⁶ CFU/g，角蛋白酶酶活≥100 U/g）由广东海洋大学动物营养分子研究室配制。

1.2 仪器设备

电子分析天平（舜宇恒平仪器），高速冷冻离心机（广州吉迪仪器），生化培养箱（上海合恒仪器），气浴振荡器(常州润华电器)，实验室净化工作台（东莞佰鸿净化设备BH-1000），迷你混合仪（拓赫MIX-VR），磁力搅拌器（上海梅颖浦MYP11-2），电热鼓风干燥箱（上海博讯BGZ-70），酶标仪（HBS-1096A），分光光度计(南京菲勒仪器)，冰箱（海尔），三角瓶和培养皿等。

1.3 试验设计及试验日粮

选用平均体质量(36.17±2.24) kg的育肥母猪18头，随机分成3组，每组6个重复，各组间体质量无较大差异（P>0.05）。试验设计分为对照组A和2个处理组（B和C），具体见表1。

其中，正常饲料所添加的ZEA均为实验室统一采购。A组饲料中，黄曲霉素、赤毒素和烷基苯酚均未检出。B组和C组饲料中ZEA含量为300 μg/kg，黄曲霉毒素、赤毒素和烷基苯酚均未检出。

试验饲料按照美国国家科学研究委员会NRC^[13]推荐配备。基础日粮配方及营养水平见表2。

1.4 饲养管理

每天打扫猪圈，分别在 10:00 和 16:00饲喂，饲养期间，猪自由采食和饮水。

1.5 生产性能的测定

试验0、3、10、17和24 d，每天早上母猪进食前称取每头猪空腹体质量，进食后记录每头猪的采食量并观察母猪精神与健康状况。测定3组母猪的生长性能指标：平均日增质量（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。随时观察猪只的活动情况及进食饮水状况。

1.6 阴户面积测定与计算

试验采用雷元培^[11]的方法进行计算，测定猪的阴户面积（S，mm²）。

S=（π×a×b）/4，

式中，a为阴户横截面的长度，mm；b为阴户竖截面的长度，mm。

母猪阴户形状如椭圆形，如图1所示。根据各组母猪阴户面积大小评价阴户是否正常与恢复情况。

1.7 屠宰试验

屠宰试验分别从3个试验组中各选择3头猪进行屠宰。宰后分离出心脏、肝脏等组织器官并称质量。放入-20 ℃冰箱冷藏，为后续器官指数的计算与肝脏的残留ZEA做准备。屠宰前对猪耳朵背部进行静脉采血，分离出血清，放入冰箱中保存备用。

1.8 器官指数的测定

器官指数=脏器鲜质量/体质量×100。

1.9 血清学指标的测定

在饲养试验结束当天，采取育肥母猪前腔静脉血液3 mL于促凝管中，待吸出血清，分别测定促卵泡激素(FSH)、促黄体素(LH)、雌二醇(E2)和催乳素（PRL）含量，均采用定量检测试剂盒测定。试剂盒选购自南京建成生物工程研究所，检测方法严格按照试剂盒说明方法进行。

1.10 肝脏中残留ZEA的测定

将肝脏组织研磨取样1.0 g，与5 mL 70%甲醇溶液进行混合，放置于振荡器中，进行离心操作，取上清液并添加去离子水1 mL，以上步骤均按照ZEA测定试剂盒说明书进行。

1.11 数据分析

采用SAS 9.0对生长指标和血清学指标结果进行数据分析。用GLM过程进行方差分析，结果用“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 不同ZEA含量饲料对育肥母猪生长性能的影响

如表3所示，24 d的饲养试验结束后，3组猪的平均日增质量、平均日采食量和饲料转化率差异较小（P>0.05）。结果显示当饲料中ZEA含量为300 μg/kg时对育肥母猪生长性能没有明显影响。

2.2 益生菌对饲喂ZEA污染日粮育肥母猪阴户面积和器官指数的影响

由图2可见，喂养母猪前3 d内，3组的育肥母猪阴户面积没有明显差异（P＞0.05），处于正常状态。试验进行到第10天时，3组的阴户面积差异显著（P<0.05），与对照组A组相比，B组阴户面积明显增大，并伴随着红肿和炎症症状。试验到第17天，C组中育肥母猪的阴户面积逐渐恢复正常，而B组育肥母猪的阴户面积依然较大，且阴户发炎发肿症状持续恶化。试验至24 d时，3组的阴户面积仍然差异显著（P<0.05），但C组的母猪阴户恢复至健康水平。

由表4可知，3组育肥母猪的心脏、肝脏、脾脏和肾脏器官指数差异不显著（P＞0.05），但是生殖器官指数差异显著（P<0.05）。因为饲料中含有益生菌使处理组C的生殖器官指数降低，改善了育肥母猪阴户的症状，恢复至健康水平。

2.3 血清学指标分析

由表5可知，3组杂交育肥母猪血清中，促卵泡激素、促黄体素和雌二醇水平没有显著差异（P>0.05）。而B组血清中催乳素水平差异显著（P<0.05），由于C组添加益生菌，可以维持血清中催乳素（PRL）值处于正常水平。

2.4 肝脏中ZEA残留量的分析

由于动物机体自身对毒素的排解以及本试验加入ZEA为300 µg/kg，ZEA相对水平较低。经过对肝脏中ZEA残留的检测发现，各试验组均没有检测到ZEA的残留。

3 讨论

3.1 生长性能及饲料中营养物质消化率的变化

在饲料中添加ZEA 300.00 μg/kg饲喂后，对育肥母猪的生长发育没有产生不利影响，与其他研究者结果相似。Liu等^[14]研究发现，在母猪日粮内分别添加86.19、300 μg/kg ZEA，结果显示当试验进行到15 d时，母猪的会阴部面积明显增大，没有对母猪的平均日增质量（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料重比（F/G）产生影响。Jiang等^[15]在断奶仔猪日粮中添加1 000 μg/kg ZEA饲喂后，仔猪的生长性能没有明显差异。并且Oliver等^[16]研究发现青年母猪日粮中添加2 mg/kg ZEA饲料后，各组母猪的生长性能也没有明显差异。本试验发现，饲料中无论是否添加ZEA，皆对育肥母猪的日增质量、日采食量、饲料转化率的消化性能没有明显影响，原因可能是本试验饲料中添加ZEA的浓度没有过量，尚未对猪的生产性能造成不良影响。

3.2 母猪外阴面积与器官的指数变化

ZEA是一种雌激素类真菌毒素，主要作用于雌性动物的生殖系统，也对雄性动物有一定程度影响。Jiang等^[15]研究发现，在仔猪日粮中分别添加不同浓度的ZEA纯品，饲喂一段时间后，仔猪会出现明显的阴户肿大、发炎的症状，随着ZEA使用浓度增加，阴户红肿也会越加严重。据Andretta等^[17]研究，在28 d饲养期内，添加2 mg/kg玉米赤霉烯酮的母猪的最终外阴体积比对照组大820%(P<0.05)，但没有对动物生长性能造成影响。Teixeira等^[18]研究发现，青春期前母猪饲喂含0.75 mg/kg ZEA的日粮连续21 d，生殖道质量、外阴面积、子宫内膜腺体上皮细胞高度及子宫黏膜高度均显著增加(P<0.05）并出现外阴户红肿现象。Jiang等^[15]也发现，断奶仔猪被饲喂含有1.1 mg/kg ZEA的日粮后，经20 d饲喂，外阴户面积与对照组相比有着较大差异。本试验发现，B组、C组饲料中添加ZEA 300 μg/kg饲喂后导致了母猪的阴户面积增大，同时伴有发炎肿胀等症状。而在添加益生菌的C组中，可以明显改善母猪阴户发炎、发肿的症状，减少阴户面积的增加，使其恢复至健康状态。

3.3 肝脏组织器官中ZEA残留量的变化

王定发^[19]在母猪日粮中分别添加500、2 000 μg/kg的ZEA日粮，其肝脏ZEA残留量分别为26.31、291.14和1 352.06 μg/kg。随着饲料中ZEA含量的增加，检测到肝脏中ZEA的残留量增加明显（P<0.05），但本试验却在肝脏中没有检出ZEA，这可能是因为饲料中ZEA的含量不高，本试验中ZEA最高为300 μg/kg，比王定发^[19]添加ZEA的最低浓度还要低。

3.4 血清学指标的变化

由于ZEA在结构上与雌激素相似，与雌激素受体在母猪体内结合后，可使雌激素发生反应，产生类雌激素相关作用，出现雌激素综合症状。根据Zielonka等^[20]研究，2种剂量ZEA（20和40 µg/kg）均能够使雌二醇和睾酮含量超出生理水平，并且高剂量ZEA更易引起内分泌紊乱。据王定发^[19]报道，日粮中添加ZEA能使仔猪血清指标中的雌二醇和促黄体素与正常对照组产生显著差异（P<0.05），但是对促卵泡激素水平没有显著影响。同时，Jiang等^[15]报道，断奶仔猪采食含有ZEA饲料后，血清中雌二醇含量显著降低（P<0.05）。本试验结果显示，处理组B采食含ZEA的饲料会使血清中催乳素升高，但是对血清中其他指标没有显著影响。而处理组C在饲料中添加益生菌后，血清中催乳素可恢复至健康水平。

4 结论

该试验结果表明，饲料中添加300 µg/kg ZEA后，育肥母猪在10 d内就会出现阴户面积增大现象。在饲料中添加0.2%益生菌后可以有效减轻母猪的外阴红肿与阴户面积增大现象，使母猪的生长性能接近正常对照组水平，维持母猪血清中雌激素水平正常，对采食含有玉米赤霉烯酮日粮的育肥母猪有治疗效果。

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