牛病毒性腹泻病毒检测方法研究进展

摘要

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒感染牛引起牛发生呼吸道疾病、免疫抑制及生殖障碍等特征的急性、高度接触性传染病。由于牛感染该病后与其他引起牛腹泻的病症类似，需要根据不同的情况选择相应的检测方法，及时切断BVDV牛群间的相互传播，减少因感染该病而造成的经济损失。因此，建立快速、准确的检测方法对该病的防控尤为重要。本文综述了牛病毒性腹泻病原及用于检测该病的检测方法，如病毒分离鉴定、RT-PCR、微滴式数字RT-PCR（dd-PCR）、纳米PCR、二温式PCR等检测技术，以期为牛病毒性腹泻的科学检测、诊断及防控提供理论基础。

关键词

牛病毒性腹泻 / 病原 / 病毒的分离鉴定 / 核酸检测技术 / 血清学检测

牛病毒性腹泻（bovine viral diarrh，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrh virus，BVDV）感染牛而引起病牛出现发热、咳嗽、腹泻、发育迟缓以及怀孕母牛流产或产畸形胎为主要特征的1种急性、高度接触性传染病^[1-2]。该病的易感动物以牛为主，其中，幼犊最易感且死亡率较高；此外，其还可感染猪、羊、骆驼等动物^[3-4]。

目前，该病被我国认定为三类传染病，感染后发病机制较为复杂，除了导致呼吸道和消化道损伤、生殖障碍及生长发育迟缓外，还可引起继发性感染与持续感染，严重危害我国肉牛养殖业的健康发展，也给肉牛养殖业造成了巨大的经济损失^[5]。

临床上常用的检测方法主要包括病毒的分离鉴定、核酸检测技术、血清学检测方法，不同检测方法的特异性、敏感性、适用的场景及所需的时间也不同，本文综述了BVDV常用的检测技术研究进展，以期为BVDV的检测、诊断及防控提供思路。

1 BVDV病原特性

BVDV是隶属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），有外膜、有纤突、形状为球形的单股正链RNA病毒，长12.3~12.8 kb；包括3种不同的基因型，即BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3，每种基因型也被分成了不同的亚型，在我国主要流行的是BVDV-1型的1 m~1 v^[6-8]。一般，BVDV病毒粒子的直径为40~60 nm，极少部分的病毒粒子直径超过65 nm，由拟核、核衣壳及脂双层构成^[9]。BVDV入侵宿主细胞进行复制和生存依靠的是宿主细胞的细胞组成成分和生物多样性，因此，当BVDV侵入宿主机体后，其基因组会与宿主蛋白之间发生相互作用，从而使宿主细胞无法维持原有的活性和正常的生物学功能，由此使细胞发生病变死亡并引起机体持续性感染和继发感染^[10]。

BVDV可以在胎牛肾细胞、猪肾细胞、胎羊睾丸细胞等原代细胞中进行传代，与猪瘟病毒抗原关系密切，为同属病毒；对氯仿、乙醚、胰酶等敏感，高温条件下可杀灭该病毒，50 ℃ 60 min或100 ℃ 2 min可被完全灭活^[11]。

2 检测方法

目前，防控BVDV最主要的方法是检测持续感染（persistently infected，PI）动物，消灭并防止PI动物在动物种群中传播至关重要，在初期阶段尤其是在动物出生不久后就对PI动物进行检测对于实施BVDV的防控计划来说意义重大。现如今，针对BVDV可用的检测方法有很多，总体分为病毒分离法、核酸检测法和血清学检测法。每种检测方法都有其各自的优势及弊端，需依据不同的诊断情况与动物的年龄来选择适合的检测方法。

2.1 病毒分离鉴定

取患病动物的组织样本进行培养和鉴定BVDV是实验室最基础的鉴别诊断方法，同时也一直是诊断技术中的“金标准”，适用于多种不同的病毒以及新发流行病毒的鉴别诊断^[12]。可采集的样本包括病畜的血液、脏器及淋巴组织等，将样本进行研磨、反复冻融、离心的方式处理，之后使用原代细胞进行培养，待病毒在细胞中进行增殖后进行鉴定和定量检测^[13]。王勤等^[14]将采集的新鲜样本经反复冻融、研磨、离心处理后，接种于单层MDBK细胞盲传10代，之后利用RT-PCR与间接免疫荧光进行检测。盲传10代后，MDBK细胞出现细胞圆缩和拉网脱落等明显的典型细胞病变，同时，RT-PCR检测为阳性、间接免疫荧光为特异性绿色荧光。王妍瑾等^[15]通过将临床样品进行破碎、离心处理后，将其接种于MDBK细胞中盲传5代，随后经RT-PCR检测并使用透射电镜进行观察。盲传5代后，MDBK细胞虽未明显出现细胞病变，但RT-PCR结果显示阳性，同时在透射电镜下也观察到呈球形、有外膜、直径40~60 nm的病毒颗粒。赵辉等^[16]从宁夏地区采集牛全血，处理后接种至MDBK细胞进行病毒增殖，盲传7代后用寇氏法（Karber）公式来计算所分离病毒的半数组织细胞感染量（TCID₅₀值），同时用透射电镜观察病毒粒子形态。结果显示，盲传3代后，部分细胞出现死亡、聚集、形成空斑，之后不断圆缩、死亡并脱落，传至7代时，病变依旧明显。电镜下可见直径40~60 nm的病毒粒子，测得病毒滴度为10^7.0 TCID₅₀/0.1 mL。王慧慧等^[17]将牦牛血清中分离的病毒接种至MDBK细胞进行传代，观察细胞病变，同时测定TCID₅₀值。接种病毒后5 d，MDBK细胞出现变圆、间隙增大、胞浆出现空泡，最后出现“蛛网”现象，呈现出典型的细胞病变。Karber法测定的TCID₅₀值为5.0×10^6.5/mL。虽然，病毒分离鉴定法重复性强，比较容易控制，但由于病毒分离法对实验室要求较高且属于劳动密集型，往往需要几天时间才能完成，试验周期较长，因此，该方法不适用于大规模的样本监测。

2.2 BVDV核酸检测

随着核酸检测技术的不断发展，检测BVDV的核酸方法除了常规PCR之外，RT-PCR、微滴式数字RT-PCR（dd-PCR）、纳米PCR、二温式PCR等检测方法相继出现。

鲍显伟等^[18]根据GenBank中已经公布的BVDV 5'-UTR基因序列和牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinortracheitis virus，IBRV）的gB基因序列分别合成了特异性的引物，通过不断优化反应条件，最终建立了可以同时检测BVDV和IBRV的双重PCR检测方法，同时也测试了该方法的特异性、重复性及灵敏性。结果显示，该方法对BVDV、IBRV、IBRV/BVDV分别扩增出198、500、500/198 bp的特异性目的条带，对其他牛病病毒和牛支原体的检测结果均为阴性；BVDV+IBRV混合液中的BVDV和IBRV的最低检测限分别为10³、10⁴ copies/μL；经3次重复性试验后结果均无变化。而采用该方法检测的79份临床可疑样本中，BVDV、IBRV、IBRV+BVDV的检出率分别是12.66%、17.72%和8.86%，与BVDV和IBRV的单重PCR的结果符合率分别为90.00%和93.33%，混合感染符合率达到100%。表明该研究所建立的BVDV和IBRV双重PCR检测方法特异性、重复性、敏感性良好。为了能够快速检测BVDV通用型及BVDV-1型、BVDV-2型的检测方法，赵成莹等^[19]根据GenBank中BVDV 5'-UTR基因序列分别设计了BVDV通用引物和BVDV-1型、BDVD-2型特异性引物，建立了BVDV通用型RT-PCR和BVDV-1型、BVDV-2型分型RT-PCR并检测了该方法的重复性、符合性和特异性。结果显示，用这3种检测方法检测其他病毒均为阴性，灵敏度分别为6.84、1.08、3.03 ng；BVDV通用型RT-PCR与BVDV-1型分型RT-PCR、BVDV-2型分型RT-PCR检测方法的符合率达100%。说明建立的BVDV通用型RT-PCR与BVDV-1型分型RT-PCR、BVDV-2型分型RT-PCR检测方法具有良好的特异性、准确性和灵敏性。梁洪等^[20]根据GenBank中猪源BVDV和猪瘟病毒（clssical swine fever virus，CSFV）5'-UTR基因序列设计合成特异性引物，建立了既可检测猪源BVDV又可检测CSFV的一步法双重RT-PCR方法。该方法分别对猪源BVDV、CSFV、猪源BVDV/CSFV混合物扩增出185、342、185、342 bp的特异性条带；对猪源BVDV、CSFV、BVDV/CSFV混合物的检出灵敏度分别达0.95、0.85、8.0 ng；与猪源BVDV、CSFV一步法RT-PCR检测方法的符合率均为100%。在对94份疑似CSFV感染临床病例样品的检测应用中，猪源BVDV阳性率为14.89%，CSFV阳性率为24.47%，二者的混合感染率是5.32%。说明该双重RT-PCR检测方法的敏感性、重复性、特异性及临床应用性均良好，能够作为快速鉴别检测BVDV和CSFV的检测方法。

叶京飞等^[21]设计了BVDV的特异性引物和探针，在一步法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测法的基础上，将RT-ddPCR试验中的反转录酶、引物、退火温度、探针浓度以及该方法的反应条件进行优化，并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行测定。结果显示，商品化数字PCR试剂盒的配套试剂为该RT-ddPCR方法的最佳反转录体系，引物和探针终浓度分别为900、250 nmol/L，最佳退火温度为57 ℃；该方法对常规疫病的检测结果为阴性，3.2 copies/μL为最低检测限，重复性好，且变异系数小于5%。表明叶京飞等^[21]所建立的RT-ddPCR方法的敏感性较高、对BVDV的特异性较强、可重复性较好，可以作为BVDV早期检测的快速诊断技术。为了能够同时检测BVDV和牛冠状病毒（bovine coronavirus，BCoV）2种病原，魏宇等^[22]建立了双重纳米RT-PCR方法。该方法与牛其他病毒均无交叉反应，特异性较好，使用该方法检测33份腹泻牛的临床样品和25份腹泻鹿的临床样品，得出BVDV、BCoV和2种病原混合感染的牛样品检出率分别为15.15%、36.36%和6.06%；而鹿样品感染BVDV、BCoV和2种病原混合感染的阳性率分别为28%、8%和8%。敏感性试验的最低检出限为1 fg，是常规RT-PCR的10倍。表明所建立的方法快速、灵敏且简捷，同时能够适用于检测大批量临床样品。范晴等^[23]为了建立BVDV的二温式PCR快速检测方法，根据BVDV的5^/端非编码区设计了特异性引物。结果显示，该方法只扩增BVDV模板，检测其他牛病病毒均为阴性；对BVDV的RNA最低可检测到1 pg。

除上述方法外，环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）作为新型核酸恒温扩增技术，无需特殊设备，不仅操作简单而且具有反应时间较短、敏感性高、特异性强的特点，且特别适宜应用于地方基层的检测。雷丽霞^[24]参考了已有检测方法、在分析BVDV基因组的基础上建立了RPA和LAMP检测方法。该LAMP检测方法经过不断优化后，最终确定了其反应体系，最适反应时间为50 min，最适反应温度为62 ℃；特异性结果表明，可以区分BVDV毒株与腹泻相关的其他毒株，具有良好的特异性；敏感性结果表明，1.9×10² copies/nL是LAMP的最低检测限，灵敏度是普通PCR的10倍。随后，雷丽霞^[24]根据BVDV基因组的5'-UTR基因序列，建立了BVDV基础RPA检测方法，确定其最适反应时间为15 min，最适反应温度为37 ℃。以阳性质粒标准品为模板进行梯度稀释，确定基础RPA的最低检测限为1.9×10² copies/nL，与LAMP的最低检测限一致。最后，雷丽霞^[24]在基础RPA的基础上又建立了BVDV的LFD-RPA检测方法，确定其最适反应时间为15 min，最适反应温度为35 ℃。以cDNA为模板梯度稀释，其最低检出量为5.8×10^–2 ng/L；以阳性质粒标准品为模板进行梯度稀释，确定其最低检测限为1.9×10² copies/nL，灵敏度与基础RPA和LAMP的一致。

核酸检测因具有特异性高、反应快速的特点在国内外应用非常广泛，细菌、真菌、病毒以及寄生虫等均可使用核酸检测技术进行病原的快速检测。虽然PCR检测方法具有耗时长、工作量大、操作不便等不足，但LAMP和RPA检测技术不仅特异性高、反应快速、灵敏性强、便于操作，而且对仪器设备要求低，为在野外环境的检测与现场诊断提供了极大的便利。

2.3 BVDV血清学检测

在BVDV的血清学检测中，最常使用的方法是酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），不仅可以在短时间内取得准确的结果，而且操作便捷。葛玉凤等^[25]通过原核表达的方式，取得了BVDV重组E2蛋白，并利用其作为包被抗原建立了可以检测BVDV的间接ELISA方法。结果显示，通过此方法检测其他病毒血清，结果均为阴性，BVDV的检测灵敏度可达1:12 800；在组内和组间的重复性试验中，变异系数分别小于5%和10%，与中和试验的符合率为94.44%。魏伟^[26]将BVDV NS3蛋白中1段具有免疫反应型的重组片段作为包被抗原，建立了检测BVDV抗体的间接ELISA方法。此方法与市场内同类试剂盒的符合率高达91.3%，与8种临床上常见牛病的血清无交叉反应，重复性试验的变异系数小于10%。以上数据表明，该方法有较好的特异性和重复性。李倬等^[27]制备了牛抗BVDV及兔抗BVDV，通过超免疫血清的方式建立了检测BVDV的双抗体夹心ELISA检测方法。结果表明，100 μg/mL为牛抗BVDV IgG的抗体包被质量浓度，50 μg/mL为兔抗BVDV IgG抗体的最佳工作质量浓度，反应时间90 min，酶标抗体的工作浓度是1:8 000，阳性的判定标准为OD_{490 nm}≥0.177，重复性小于10%，最低检出限为1.87 μg/mL，与其他病原无交叉反应。

ELISA作为临床上常规的检测方法之一，一直被广泛应用，该方法既可以检测组织及脏器培养物中的BVDV，又能够用来监测大规模牛群的BVDV抗体水平。但是由于该方法所需的特异性抗原制备比较困难，且易检出假阳性，也有一定的局限性。

3 展望

一直以来，BVDV严重危害我国乃至整个世界养牛业的健康发展，给畜牧业带来极大经济损失的原因主要是对其检测不严格及活牛的流动量变大。因此，加强对BVDV的检测与监测对制定BVDV防控和净化策略意义重大。研发快速、高效的检测技术可以及时检出畜群中存在或潜在的BVDV，能够减少该病给养殖业带来的经济损失。由此可见，研发新型、高效的检测方法至关重要。除上述提到的一些检测方法外，很多新型的检测技术也正在研发过程中，如金纳米颗粒结合PCR技术、基因芯片技术和交联与非交联探针金纳米颗粒杂交技术等^[28-30]。这些方法检测准确、快速、敏感、耗时较短，一定程度上避免了假阳性出现的问题，但是部分方法依旧不适用于基层的检测。因此，研发出不需大量人力及复杂仪器且适用于基层检测的方法依旧是今后BVDV检测技术研发创新的重中之重。如今临床上所使用的检测方法均存在缺陷与优势，不同的应用场景使用的方法也各不相同，还是需根据实际情形选择最适宜的方法，在提高效率的同时也可以确保检测的准确率。随着科技的不断进步，检测方法也在飞速优化、更新、完善，为我国的BVDV防控提供支撑。

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