湖北地区鸡滑液囊支原体分离鉴定和致病性研究

Isolation, identification, and the pathogenicity of Mycoplasma synoviae in chickens in Hubei Province

摘要

目的 分析2023年1月至2024年1月湖北地区鸡滑液囊支原体的遗传特性及致病性，为湖北省鸡滑液囊支原体防控提供理论依据。 方法 将PCR鉴定阳性的病料通过液体培养基分菌，对分离纯化菌株的vlhA基因序列进行测序，用MEGA11软件分析构建进化树，并通过鸡胚感染试验及45日龄SPF鸡感染试验验证致病性。 结果 发现3株鸡滑液囊支原体与近年来国内的流行株亲缘关系最近，其中HB分离株的鸡胚感染试验显示该菌株具有较强的鸡胚致死性；动物毒力感染试验结果表明，不同剂量的菌液感染45日龄鸡，连续观察14 d，感染剂量为2×10⁶ CCU/只时，90%的鸡出现临床症状，且爪垫、趾跗关节发病部位病原分离率达到96%，龙骨囊肿部位基本无法分离到病原。 结论 本研究建立了一株鸡滑液囊支原体分离菌株的体内感染模型并分析了其感染症状与致病性，为鸡滑液囊支原体疫苗的开发和免疫保护评价提供了基础。

关键词

鸡 / 滑液囊支原体 / 分离鉴定 / 致病性 / 感染模型

Key words

chicken / Mycoplasma synoviae / isolation / identification / pathogenicity / infection model

鸡滑液囊支原体病是由滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）引起鸡和火鸡的一种传染病，又称鸡传染性滑膜炎，主要侵害鸡的呼吸系统、生殖系统和骨骼肌肉。20世纪50年代，美国科学家Olson最早发现并报道该病^[1]，2010年该病首先出现在中国南方地区，随后在全国各省蔓延开来，发病鸡的数量急剧增加，给我国的养禽业，特别是蛋鸡产业带来了巨大的经济损失^[2]。

MS感染会导致鸡出现呼吸道症状及滑膜炎，临床症状和发病程度也会因分离株的不同而有差异。感染初期部分家禽其精神状态良好且饮食正常，随着MS在呼吸道和生殖道上皮细胞的大量增殖，MS一方面会大量掠夺宿主的营养物质以维持自身蛋白质的合成；另一方面MS在定殖过程中产生的代谢产物和毒素等也会导致黏附靶细胞的死亡^[3]，此时感染个体通常表现为食欲减退，个体生长缓慢，增质量减缓，羽毛蓬乱，鸡冠苍白，若出现滑膜炎时还会表现为跛行，卧地不起等症状，严重时气囊增厚。感染的日龄越晚，对鸡只的损伤越小。此外，MS感染蛋鸡后虽然呼吸道症状不明显，但是在产蛋期会引起蛋壳顶端缺损，该症状使得蛋壳表面不再光滑，有些甚至出现黑斑。照亮钝端时，会有典型的透光边界，明显降低蛋壳品质，严重损害了农户的经济效应^[4-5]。

笔者所在实验室长期从事禽支原体病原学检测及分离鉴定工作，为了进一步了解湖北地区鸡滑液囊支原体的遗传进化规律和病原学特点，本实验室对最近分离纯化的3株鸡滑液囊支原体菌株进行了vlhA基因测序分析，并建立了分离菌株HB的本体动物感染模型，为进一步研究MS的致病特点和MS的疫苗研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1）病料。2023年1月至2024年1月湖北周边地区表现为跛行、趾关节和跗关节肿胀的发病鸡和病鸡咽喉拭子。

2）支原体培养基。改良Frey培养基购自北京中海生物科技有限公司，固体培养基制备：将固体培养基基础成分加热融化，当温度降至55 ℃左右时，添加辅助液，配制好的培养基置于4 ℃保存。

3）鸡胚及实验动物。7日龄SPF鸡胚为购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司的种蛋于武汉科前生物股份有限公司孵化后提供，45日龄SPF鸡为购自北京梅里亚维通试验动物技术有限公司的SPF种蛋于武汉科前生物股份有限公司孵化并于动物房隔离器饲养后提供。

4）主要试剂和仪器。细菌基因组DNA提取试剂盒购自康为试剂生物股份有限公司，高保真PCR酶（2×TransStart^® FastPfu PCR SuperMix）、DL 2000 DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司，恒温摇床购自武汉智诚生物科技有限公司，二氧化碳培养箱购自赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientfic）。

5）引物。鸡滑液囊支原体PCR检测引物及vlhA基因扩增引物如表1所示。

1.2 方法

1）疑似病料的PCR鉴定。MS疑似病料研磨后提取DNA，使用引物MS-F/MS-R按照NY/T 553—2015《禽支原体PCR检测方法》标准中的反应体系和条件扩增，在对照成立的情况下样品组如果出现207 bp的目的扩增条带，说明该样品鸡滑液囊支原体阳性^[6]。

2）MS分离与纯化。将PCR阳性组织处理后接种改良Frey液体培养基中。37 ℃ 5% CO₂培养箱静置培养5~10 d，直至培养基颜色变黄，再划线接种改良Frey固体平板纯化，待观察到典型的“煎鸡蛋”菌落，挑取单菌落进行液体培养，如此重复3次^[7-8]。挑取单个菌落于改良Frey液体培养基，待培养基颜色由猩红色变为橘黄色，测定活菌含量（单位CCU/mL），同时加入30%灭菌甘油，于-80 ℃保存。

3）MS分离株vlhA基因遗传进化分析。根据MS vlhA基因（GenBank登录号：AF488712.1）设计1对引物vlhA-F/vlhA-R扩增vlhA基因。PCR产物送北京擎科生物科技有限公司（武汉分公司）测序，根据vlhA基因5’端保守区域进行遗传进化分析和基因分型，序列比对结果用MEGA11软件分析构建进化树，参考Bencina的方法对MS进行分型^[9]。

4）鸡红细胞吸附试验。取5 mL 0.25%鸡红细胞悬液加入已经培养好的固体培养基表面，在室温下作用20 min，弃去红细胞悬液，用生理盐水洗涤3次，在低倍显微镜下观察，看菌落表面有无红细胞吸附。

5）鸡胚感染试验。将分离株的液体培养物传代3次后取培养物经卵黄囊接种6~7日龄SPF鸡胚，每个分离菌株共接种5枚SPF鸡胚，每枚鸡胚接种0.2 mL，另设5枚SPF鸡胚接种单纯培养基做对照。SPF鸡胚接种完毕后置37 ℃恒温孵化器继续孵化，每日观察并记录鸡胚死亡情况^[10]。

6）MS分离株感染模型的建立。HB株菌液稀释至活菌含量为1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸ CCU/mL作为感染用菌液。取45日龄SPF鸡40只，随机分为4组，10只/组。将3种稀释度的HB株菌液各爪垫注射感染1组SPF鸡，0.2 mL/只；剩下1组直接注射0.2 mL培养基作为对照组。记录感染后14 d所有试验鸡爪垫、趾关节、跗关节和龙骨病变情况，并对发病部位进行病原分离^[11-13]。根据发病症状和分毒情况确定最佳攻毒剂量、发病判断标准，建立MS分离株感染模型。

2 结果与分析

2.1 临床样品PCR鉴定

临床病料提取DNA后经PCR鉴定，部分可疑样品MS核酸检测为阳性（图1）。

2.2 MS病原分离与纯化

将2.1中MS核酸检测阳性的样品接种改良Frey液体培养基分离活菌，并经过3轮平板纯化后最终获得3株MS菌种，分别命名为HB株、AH株和HN株。将3个菌株分别接种改良Frey固体培养基，均生长良好（低倍镜下形态如图2所示）。将HB株、AH株和HN株进一步接种改良Frey液体培养基，其活菌含量分别达到10⁹、10⁸、10⁸ CCU/mL。

2.3 MS分离株vlhA基因遗传进化分析

根据MS基因组的proline-rich repeats（PRR）区域对分离株进行分型，结果表明：与标准株WVU1853相比（PRR区域含有38个氨基酸，A型），分离株AN、HN和HB株的PRR区域都缺失了3个氨基酸，PRR区域氨基酸的总数目为35个，符合L型的判定标准（图3）。

随后，通过比对vlhA基因5’端保守区域的序列，分析本研究分离的3株临床分离菌株与国内外流行菌株的进化关系。结果发现：①自2013年以后，国内的MS分离株已经进化出1个新的独立谱系，且与国外其他基因型的菌株，特别是疫苗株MS-H遗传距离较远；②尽管本研究分离的3株L型菌株与2013—2014年国内流行的L型菌株位于同一个大的分支上，但也出现了明显的遗传进化差异（图4）。

2.4 MS分离株生物学特性分析

1）红细胞吸附。选择HB分离菌株进行红细胞吸附试验，结果如图5所示，可见HB菌株可以明显吸附鸡红细胞。

2）鸡胚感染试验。利用HB株接种7日龄SPF鸡胚，结果发现，接种120 h后鸡胚均死亡，且死胚中均能分离到MS病原，表明HB分离株对鸡胚具有较强的致病性。

2.5 MS分离株感染模型的建立

利用3个剂量的HB分离菌株分别感染45日龄SPF鸡，对其感染症状和病变进行统计，结果发现感染症状主要包括足掌部肿胀、跗关节肿胀、趾关节肿胀症状和龙骨囊肿（表2），而内脏剖检未见明显病变（图6）。另外，低剂量（2×10⁵ CCU/只）、中剂量（2×10⁶ CCU/只）、高剂量（2×10⁷ CCU/只）组分别有6/10、9/10和10/10的症状表现以及5/10、9/10和10/10病原分离。感染后出现足掌部肿胀、跗关节和趾关节肿胀症状的鸡，96%在其发病部位可以分离到MS活菌，但龙骨囊肿部位基本无法分离。足掌、跗关节和趾关节没有表现出症状的鸡均无法分离到病原菌。

综上，根据对发病症状与病原分离情况的分析，可以初步制定MS感染的眼观判定标准：感染后，跛行、爪垫肿胀、趾关节肿胀和跗关节肿胀4个症状任意出现2个即判定为发病。

另外，从发病情况来看，尽管中剂量组和高剂量组的感染菌数相差10倍，但2组中跛行、爪垫、跗关节和跗关节的发病情况并未出现显著差异，因此，2×10⁶ CCU/只可以作为HB株感染45日龄鸡发病的最佳剂量。

3 讨论

本研究从疑似MS感染的病料中分离纯化得到3株MS菌株，通过遗传进化分析发现，3株分离株与近几年国内流行菌株同属于1个谱系，与国外流行株和疫苗株亲缘关系较远。尽管MS只有1个血清型，但根据不同分型方法鉴定的亚群之间的交叉免疫原性和遗传进化关系目前还未见详细报道。本研究针对MS的分离株HB开展了生物学特性检测，发现HB株能吸附红细胞，且对鸡胚有较强的致死性。回归本动物体内发现，不同剂量感染45日龄SPF鸡后发病症状和病原分离呈正相关性，符合率为96%。因此，用跛行、爪垫肿胀、趾关节肿胀和跗关节肿胀的症状来统计MS感染发病情况对于临床实践具有一定的指导意义。

本研究制定了MS感染发病的眼观判定标准值：感染后连续观察14 d，若出现跛行、足掌部肿胀、跗关节肿胀、趾关节肿胀4项中的任意2项及以上则可判定为发病；建立了HB分离株对45日龄SPF鸡的感染模型，并明确了其最佳感染剂量，为MS疫苗的免疫保护评价提供了基础。

参考文献

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基金资助

湖北省主要动植物品种选育及生物制品研发(2020ABA016)