2021—2023年云南临沧市小反刍兽疫病原学和免疫抗体检测分析

Analyzing the pathology and immunological antibody detection of Peste des petits ruminants in Lincang City, Yunnan Province, 2021—2023

摘要

目的 为全面掌握临沧市小反刍兽疫免疫效果，科学评估其感染状况。 方法 随机采集2021—2023年来自规模场和散养户的羊血清4 524份、羊眼鼻棉拭子1 000份，采用阻断ELISA方法进行小反刍兽疫抗体检测，病毒核酸荧光RT-PCR进行病原学检测。 结果 小反刍兽疫免疫抗体合格率，2022年比2021年提高了7.44百分点，2023年比2022年提高了3.11百分点，病原学未检测出小反刍兽疫病毒核酸阳性样品。 结论 临沧市以“人病兽防、关口前移”各项防控措施为抓手，小反刍兽疫的免疫效果总体较好。

关键词

小反刍兽疫 / 抗体检测 / 病原学检测 / 疫苗免疫 / 小反刍兽疫病毒 / 荧光RT-PCR

Key words

Peste des petits ruminants (PPR) / antibody detection / pathological detection / vaccine immunization / peste petit ruminant virus / fluorescent RT-PCR

小反刍兽疫（PPR，也称羊瘟）是由副黏病毒科麻疹病毒属小反刍兽疫病毒（PPRV）引起的，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征的急性接触性传染病，山羊和绵羊易感，以高发病率和高死亡率为特征^[1]，发病率通常达60%以上，甚至可达100%，病死率可达50%以上。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病^[2]。小反刍兽疫一年四季均可发生，但多雨季节和干燥寒冷季节更易发。由于该病致死率高，对畜牧业发展有极大的危害，也是近年来一经确诊就要采取封锁扑杀措施的一类传染病^[3]。

云南省临沧市动物疫病预防控制中心兽医实验室工作人员春秋两季分别于2021—2023年在临沧市8个县区随机采集规模场和散养大户羊血清样品共4 524份，羊眼鼻棉拭子1 000份，进行免疫抗体和感染状况检测，以期为临沧市小反刍兽疫防控预警提供科学的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1）待检血清样品。2021—2023年羊血清4 524份，羊眼鼻棉拭子1 000份。血清样品均来自规模场和散养大户，采集的血清多为免疫羊群，在羊群已免疫的基础上对所有新生羔羊和外调羊只进行小反刍兽疫强制免疫，疫苗免疫接种方法及剂量按相关产品说明书规定操作。血清均无溶血，无腐败，无冻胶，离心后吸取上清液备用。

2）免疫疫苗。疫苗名称，小反刍兽疫活性疫苗；疫苗厂家，天康生物股份有限公司。

3）试验器材。多道移液器，单道移液器，酶标仪，恒温箱，微量振荡器，全自动核酸提取仪，生物安全柜，荧光分析仪等。

4）试验试剂。小反刍兽疫病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒（PPRV B抗原包被板、PPRV B酶结合物、PPRV B阴性血清、PPRV B阳性血清、PPRV B样品稀释液、20倍洗涤液、底物溶液、终止液）；羊小反刍兽疫病毒荧光RT-PCR检测试剂，试剂盒均购于青岛立见生物科技有限公司。

1.2 抗体检测方法

1）洗液的配制。将20倍洗涤液用蒸馏水稀释20倍，充分混匀备用。

2）加样。在A1和B1孔加入PPRV B阴性血清各50 μL；在C1和D1孔加入PPRV B阳性血清各50 μL；在E1和F1孔加入样品稀释液各50 μL；剩余孔中加入25 μL样品稀释液，然后加入待检血清25 μL，轻轻振动孔中样品，贴上封板膜在37 ℃恒温箱孵育60 min。

3）洗板。甩干PPRVB抗原包被板孔中的液体，每孔加入280 μL配制好的洗液，洗涤4次；每孔加入50 μL酶结合物，贴上封板膜在37 ℃恒温箱孵育30 min。

4）重复步骤。按“1.2 3）”中每孔加入280 μL配制好的洗液，洗涤4次；每孔加入50 μL底物溶液，于室温条件下避光反应15 min；每孔加入50 μL终止液，混匀，终止反应。酶标仪（测量波长：450 nm）上测量并记录样品结果。

5）结果判定。PPRVB阴性对照血清的平均OD值即OD_Nc，PPRVB阳性对照血清的平均OD值即OD_pc，酶标抗的平均OD值即OD_cm，待检血清的OD值即OD_s。

阳性对照血清阻断PB_pc=100－OD_pc/OD_cm×10；阳性对照血清阻断PB_pc=100－OD_pc/OD_cm×10；阴性对照血清阻断率PB_c=100－OD_wc/OD_cm×100；待检血清阻断率PB_s=100－OD_s/OD_cm×100。

6）试验成立条件。PB_Nc<40且PB_c>60，试验结果有效；否则，重新进行试验。判定：在试验成立的前提下，待检血清阻断率PB_s>50，结果判为阳性；PB_s≤50，结果判为阴性。

1.3 病原学检测方法

1）RNA提取。采用自动核酸提取仪提取RNA病毒核酸，并吸取装入八连管中备用，操作方法严格按使用说明书进行。

2）荧光RT-PCR反应。根据检测样品数量每孔PCR反应管加入20 μL PT-PCR反应液；先吸取5 μL待检RNA，再吸取5 μL阴/阳性血清分别加入不同的反应八连管中，充分混匀，每个PCR反应管内的体积为25 μL。在荧光分析仪上设置50 ℃反转录15 min；95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s；60 ℃延伸30 s，共40个循环；设置60 ℃收集FAM荧光信号，反应管在荧光PCR仪上反应。

3）结果的有效性。阳性对照应出现特异性扩增曲线Ct值＜35，且阴性对照无特异性扩增曲线或无Ct值，则试验成立，否则试验不成立。

4）结果判定。当样品的扩增结果有典型的扩增曲线且Ct值≤40时可判定为小反刍兽疫病毒核酸阳性；Ct值>40或无Ct值时可判定为小反刍兽疫病毒核酸阴性。

2 结果与分析

2.1 免疫抗体结果分析

由表1可知，2021年共检测样品数1 429份，抗体合格数1 021份，合格率71.45%；2022年共检测样品数1 478份，抗体合格数1 166份，合格率78.89%；2023年共检测样品数1 617份，抗体合格数1 326份，合格率82.00%。小反刍兽疫的免疫效果总体较好，2022年比2021年合格率上升了7.44百分点，2023年比2022年上升了3.11百分点，甚至有些县（区）免疫合格率达90%以上，可给羊只提供良好的保护力。但2021—2023年分别有4、2、2个县（区）免疫合格率未达到农业农村部规定的70%最低标准，为疫病暴发埋下了隐患。

2.2 病原学监测结果分析

由表2可知，2021—2023年小反刍兽疫病原学分别检测320、320、365份，均未检测出小反刍病毒核酸阳性样品。说明临沧市近年来小反刍兽疫病原学感染较小，疫情发生风险较低。

3 讨论

随着临沧市兽医社会化服务工作的有序推进和动物防疫整村推进工作的持续开展，保证了全市动物免疫密度维持在相对较高的水平，但通过实验室监测结果表明，全市各县（区）免疫空白点，集中免疫后补免工作滞后，部分区域直接不开展补免工作，导致部分县区动物疫病免疫合格率偏低。

近几年，虽然临沧市未发生过小反刍兽疫疫情，但周边州市先后发生小反刍兽疫疫情，特别在2014—2015年全国多个省市、云南多个地州、临沧周边的州市都先后发生了小反刍兽疫疫情。面对严峻的疫情形势，临沧市高度重视，积极应对，按照“人病兽防，关口前移”的总体要求，做到早发现、早预警、早应对，推进畜牧业高质量发展，控制人兽共患病，切实保障和维护临沧畜牧业生产安全发展、公共卫生安全和国家生物安全。

3.1 开展疫情排查和流行病学调查

做好疫情排查和流行病学调查是及时消除疫情发生隐患的关键。加强历年来羊只流通性较频繁区域以及不明原因死亡情况的排查和流行病学调查工作。

3.2 加大免疫注射力度

一是做好集中免疫和补免工作，有效降低重大动物疫病发生的风险。对存栏羊只进行小反刍兽疫强制免疫；对所有新生羔羊和外调羊只进行小反刍兽疫强化免疫。二是做好疫苗调运保障，各级动物防疫机构安排专人负责疫苗的订购、发放及组织运输，保证疫苗质量。三是加快推进临沧市兽医社会化服务工作，全面提升兽医公共服务能力，以整村推进为抓手，抓实免疫措施，打牢防控基础，加大补免工作力度，确保免疫密度和免疫质量。

3.3 加强实验室监测

对重点区域、羊养殖大户（规模场）开展免疫抗体监测，准确掌握免疫效果，及时发现免疫漏洞，科学指导开展免疫工作。

3.4 加强境外疫情防控

一是禁止境外动物及其产品入境；二是加大巡查力度，打击非法入境动物及产品交易行为，防止境外疫情传入；三是以规模养殖场为重点，抓实养殖大户监管力度，做好督促检查，加快推进“先打后补”工作；四是抓实检疫监督工作，强化种畜跨区域调运的检疫监管，杜绝因引种导致疫情的传入。

4 结论

临沧市总体的防疫较好，小反刍兽疫免疫情况也呈逐年上升趋势，临沧山区面积占97.5%，养殖户多为山区养殖，虽然有很好的天然屏障，但仍然存在点多面广的特点。一是集中免疫时期防疫人员少，导致部分区域存在免疫空白。二是在注射过程中，稀释后的疫苗应在0.5 h内用完，如果疫苗保存不当，就容易导致疫苗效价降低，从而对羊只起不到保护作用。三是农户重视度不够。有些老百姓思想观念陈旧，不接受免疫，防疫员的工作很难开展。四是饲养管理不当。饲养羊只营养不良，免疫时免疫力低下，对疫苗的免疫应答下降，导致免疫不成功^[4-5]。

参考文献

[1] 牟国月. 小反刍兽疫诊断技术及防治[J]. 中国畜禽种业, 2022,18(2):85-86..

[2] 刘锦红. 羊小反刍兽疫鉴别诊断和防治措施[J]. 特种经济动植物， 2023，26(5)：71-73.

[3] 王美菊， 成小莉， 王玙， 天水市2015—2018年羊小反刍兽疫免疫抗体检测结果分析[J]. 畜牧兽医杂志， 2019，38(3)：22-23.

[4] 黄丽非， 秦桂清， 张色萍， 2018年崇左市小反刍兽疫免疫抗体监测结果分析[J]. 广西畜牧兽医， 2019，35(4)：182-184.

[5] 杨娴娟, 吴永辉, 杨娴婧. 某养殖场新引进羊小反刍兽疫免疫抗 体及病原学检测[J]. 中国草食动物科学, 2020,40(6):51-54.