酮康唑-甲基-β-环糊精包合物的表征及抑菌活性研究

Characterizing the inclusion complex of ketoconazole-methyl-β-cyclodextrin and its antibacterial activity

摘要

目的 为了提高低水溶性抗真菌药物酮康唑（ketoconazole，KCZ）的水溶性及抑菌活性，减少临床应用限制。 方法 采用饱和溶液法制备酮康唑-甲基-β-环糊精包合物，高效液相色谱法（HPLC）检测其溶解度，通过傅里叶变换红外光谱（IR）法对其结构进行表征，用纸片扩散法（K-B法）和最小抑菌浓度(MIC)方法对比检验酮康唑原药与酮康唑-甲基-β-环糊精包合物对白色假丝酵母菌的体外抗菌活性。 结果 通过甲基-β-环糊精包合，酮康唑在包合物中的水溶性比单一酮康唑增加了约2 941倍，通过傅里叶变换红外光谱（IR）法证实了有新物相形成。酮康唑原药的抑菌圈为（22.00±1.63） mm，酮康唑-甲基-β-环糊精包合物的抑菌圈则提升至（28.00±1.63） mm。最低抑菌浓度结果显示，酮康唑原药的最低抑菌浓度为（0.125±0.029） μg/mL，酮康唑-甲基-β-环糊精包合物的最低抑菌浓度为（0.062 5±0.015 0） μg/mL。 结论 酮康唑-甲基-β-环糊精包合物不仅没有破坏酮康唑原药对白色假丝酵母菌原有的抑菌能力，还提高了其抑菌效果。

关键词

酮康唑 / 包合物 / 傅里叶变换红外光谱 / 药敏试验 / 最小抑菌浓度

Key words

ketoconazole / inclusion complex / Fourier transform infrared spectroscopy (IR) / test of drug sensitivity / Minimum inhibitory concentration (MIC)

畜禽的真菌感染被称为家畜真菌病，由于其病程长、传染性强、传播途径广等特点，导致该病的治疗非常困难，这对动物健康构成了严重威胁^[1-2]。唑类抗真菌药物是目前种类最多、使用量最大的药物类别^[3]，在众多唑类药物中，酮康唑（ketoconazole，KCZ）以其价格低廉、抗菌谱广、抗真菌活性强等优点脱颖而出。并且，它对皮肤癣菌、隐球菌、曲霉菌、念珠菌等病原菌也表现出良好的抑菌活性。因此，酮康唑被广泛地用于治疗真菌感染^[4-7]。然而，酮康唑的低水溶性、肝脏毒性和药效缓慢等副作用，限制了其在治疗真菌感染上的应用^[8]。为了更好地利用酮康唑，提高其在临床上的应用价值，通过与环糊精包合，提高了其水溶性、稳定性和抑菌作用，同时降低了其毒副作用^[9]。本文采用饱和溶液法制备酮康唑-甲基-β-环糊精包合物，并对其结构进行表征，对比检验酮康唑原药与酮康唑-甲基-β-环糊精包合物对白色假丝酵母菌的体外抗菌活性，以期提高低水溶性抗真菌药物酮康唑的水溶性及抑菌活性，减少临床应用限制。

1 材料与方法

1.1 材料

1）试验菌株。白色假丝酵母菌标准菌株(Candida albicans）（CMCC 98001），广东省微生物菌种保藏中心产品。

2）试验试剂。无水乙醇（分析纯），天津扶余精细化工有限公司；甲醇（分析纯），广东光华科技股份有限责任公司；甲醇（色谱纯），国际贸易公司；酮康唑（纯度≥98%），甲基-β-环糊精(取代度11.2~13.3，平均相对分子质量1 303.3)，上海阿拉丁生化科技有限公司；麦芽汁琼脂培养基，广东环凯微生物科技有限公司；沙氏葡萄糖液体培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；麦氏比浊管，珠海贝索生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO），甘油（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

3）试验仪器。磁力搅拌器（RCT digital），德国IKA公司；紫外可见分光光度计（J51903001），上海菁华科技仪器有限公司；安捷伦高效液相色谱仪（1260 infinity），安捷伦科技（中国）有限公司；高压灭菌锅，恒温振荡培养箱（SPX-250B-D），超净工作台（SW-CJ-1FD），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；一次性培养皿，96孔板，比克曼生物科技有限公司。

1.2 方法

1）包合物的制备。称取适量酮康唑和甲基-β-环糊精，分别使用无水乙醇和超纯水溶解，将甲基-β-环糊精饱和水溶液逐步滴至酮康唑乙醇溶液中，设置一定时间置于恒温磁力搅拌器搅拌，放置–20 ℃冰箱中过夜，抽滤除去有机溶剂，纯水洗涤后，置于真空冷冻干燥箱中干燥，制得酮康唑-甲基-β-环糊精包合物。

2）检测波长的确定。精密称量甲基-β-环糊精、酮康唑，分别加超纯水及甲醇制备成适宜浓度的溶液，以相应的溶剂为空白溶液，使用分光光度计（UV）在200~400 nm波长范围内检测其最大吸收波长。

3）标准曲线的制备。精密称取酮康唑10 mg于10 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容。取上述溶液稀释，分别配制成质量浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL工作液。将其使用高效液相进行检测，以酮康唑浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

4）包合物溶解度测定。在1 mL超纯水中加入过量酮康唑-甲基-β-环糊精包合物粉末，制备成过饱和溶液，置于涡旋机涡旋，经0.22 μm微孔滤膜过滤，进行HPLC分析，由回归方程计算得到包合物的含量^[10]，每个样品制备3个平行样品。

5）傅里叶变换红外光谱。研磨溴化钾和酮康唑、溴化钾和甲基-β-环糊精、溴化钾和包合物、溴化钾的物理混合物，分别压片得到4个透明的片状物，依次装入样品架，分别在500~4 000 cm^-1之间扫描样品。

6）培养基的配制。麦芽汁琼脂培养基：分别称取麦芽膏粉130 g、琼脂15 g、氯霉素0.1 g，溶于1 L超纯水，煮沸至完全溶解，115 ℃灭菌15 min。沙氏葡萄糖液体培养基：分别称取蛋白胨10 g、葡萄糖20 g，溶于1 L超纯水，121 ℃高压灭菌15 min。

7）菌株的复苏和冻存。将菌种冻干粉溶解后划线于麦芽汁琼脂培养基，置于（27±1） ℃培养2 d，传代后，再挑取单个菌落至沙氏葡萄糖液体培养基（27±1） ℃培养1 d，按菌液:甘油（1:1，V/V）进行保种，置于–80 ℃备用。试验时置于常温下解冻，活化后使用。

8）菌悬液配制。从生长白色假丝酵母菌的固体培养基上挑选状态较好的白色假丝酵母菌单菌落，接种于沙氏葡萄糖液体培养基中，（27±1） ℃条件下恒温培养1 d后取出菌液，使用比浊管将菌悬液调至1×10⁶~5×10⁶ CFU/mL，备用。

9）试验药物及药液配制。酮康唑原药（KCZ），酮康唑-甲基-β-环糊精包合物（KCZ-M-β-CD），均使用二甲基亚砜（DMSO）溶解后加超纯水稀释，药敏纸片含药量为15 μg，MIC药物储存液为1 600 μg/mL，工作质量浓度为32 μg/mL，最终DMSO不超过1%，以免影响结果。

10）药敏纸片的制备。将空白药敏纸片经121 ℃高压灭菌20 min，置于恒温干燥箱内干燥后放至瓶中。

11）纸片扩散法（K-B法）。用无菌棉签蘸取2次1×10⁶~5×10⁶ CFU/mL的菌悬液并在管壁挤去多余液体后，将菌悬液均匀涂布（注意边缘）于麦芽汁琼脂培养基平板表面。重复3次，每次将平板旋转60 ℃再进行涂布，最后涂布平板边缘。将药敏纸片贴在琼脂表面，药物及包合物分别滴加至药敏纸片上，轻微加压保证纸片与琼脂贴合紧密。倒扣置于（27±1） ℃培养1~2 d，根据NCCLS标准观察各药敏纸片周围抑菌圈大小并记录其直径（表1）。抑菌圈直径取最大直径和最小直径的均数，同时制备3个平板。

12）最小抑菌浓度。白色假丝酵母菌在麦芽汁琼脂培养基中（27±1） ℃培养1 d，挑取单菌落至沙氏葡萄糖液体培养基，摇床摇12 h。将其使用比浊管调至1×10⁶~5×10⁶ CFU/mL作为菌液的储备液。MIC值采用微量肉汤二倍稀释法测定^[7-8]，酮康唑原药及酮康唑甲基-β-环糊精包合物的工作质量浓度为32 μg/mL。

向96孔板第1~10孔每孔均加入100 μL沙氏葡萄糖液体培养基，每列第1孔加入需检测药物100 μL，倍比稀释至第10孔，最后1孔弃掉100 μL，再每孔加入100 μL菌悬液。使得药物起始质量浓度为16 μg/mL，终末质量浓度为 0.031 3 μg/mL，第11孔加入200 μL沙氏葡萄糖液体培养基，为阴性对照组，第12孔加入200 μL菌悬液，为阳性对照组。第1列为酮康唑，第2列为酮康唑-甲基-β-环糊精，重复3次。

接种后将96孔板轻轻振动30 s，使药液与菌液充分混匀，于（27±1） ℃培养箱中静置培养1 d，根据真菌MIC分数及厂家标准判断结果（表2、表3）。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

由图1可知，酮康唑标准溶液在（255±1） nm处有1个吸收峰，空白对照溶液在此处无吸收，因此选择（255±1） nm波长进行含量测定。

2.2 标准曲线

由图2可知，检测酮康唑甲基-β-环糊精包合物的含量，带入标准曲线计算酮康唑甲基-β-环糊精包合物的溶解度为（50.0±2.4） mg/mL，比酮康唑原药溶解度提高了约2 941倍，表明甲基-β-环糊精能有效改善酮康唑的水溶性。

2.3 傅里叶变换红外光谱

傅里叶变换红外光谱是将特征吸收峰与原药相比看是否发生位移、降低或消失来判断包合物是否形成。

由图3可知，酮康唑的特征峰出现在2 966、2 884~2 833、1 654、1 224、1 201和814 cm^-1处分别对应C―H，C═O，C―N，C―O―C和C―Cl，在物理混合物中可见，在包合物中发生变化或减少，证实了有新的物相形成。

2.4 纸片扩散法（K-B法）

采用纸片扩散法测定抑菌效果，结果如图4所示，酮康唑原药的抑菌圈为（22.00±1.63） mm，酮康唑-甲基-β-环糊精包合物的抑菌圈为（28.00±1.63） mm，药物的敏感性由培养基上的抑菌圈大小来判断。由图4可知，酮康唑原药及酮康唑-甲基-β-环糊精包合物对白色假丝酵母菌均为敏感，但抑菌圈直径有所增加，表明通过甲基-β-环糊精包合不仅没有破坏酮康唑原药原有的抑菌活性，还有所提高。

2.5 最小抑菌浓度

白色假丝酵母菌的判读标准为孵育24 h后，阳性对照孔出现浑浊，阴性对照孔内澄清，且从左到右真菌生长呈梯度抑制时才可判定试验成功。与生长对照孔比较，将测试孔菌株生长抑制情况按照表2进行评分。

酮康唑原药及酮康唑-甲基-β-环糊精包合物对白色假丝酵母菌MIC值见图5，由图5可知，酮康唑原药的MIC为（0.125±0.029） μg/mL，酮康唑-甲基-β-环糊精包合物的MIC为（0.062 5±0.015 0） μg/mL，根据表3假丝酵母菌体外敏感性试验结果解释标准，表明酮康唑原药及酮康唑-甲基-β-环糊精包合物对白色假丝酵母菌均为敏感，但酮康唑-甲基-β-环糊精包合物对白色假丝酵母菌的敏感性有所增强。

3 讨论

唑类抗真菌药物的抗菌谱广，被广泛应用于浅部真菌病的治疗^[11]。酮康唑是临床上第1个可口服的广谱咪唑类抗真菌药物，至今广泛应用于临床并获得了较好的疗效^[12]。然而，由于酮康唑存在肝毒性等副作用，这在一定程度上限制了其在临床中的应用^[13-14]。

本试验使用饱和水溶液法制备酮康唑-甲基-β-包合物，饱和水溶液法适用于制备难溶于水的药物的包合，该方法操作简单易行，适合批量生产。试验结果表明，酮康唑-甲基-β-环糊精包合物的溶解度有显著提高，比酮康唑原药增加了约2 941倍，红外光谱技术有助于辨别在包合过程中药物和环糊精的哪种振动模式受到干扰，并表明这些分子在固态中相互作用^[15-16]，通过物相鉴定可以看到酮康唑的特征峰在包合物中发生变化，证明其形成了新的物相。

纸片扩散法与微量稀释法相结合的方式均证实了酮康唑-甲基-β-环糊精包合物比酮康唑原药对白色假丝酵母菌的敏感性更高，抑菌活性更好。这表明，在临床应用时，可以减少使用的药物剂量，从而达到减少副作用的目的。纸片扩散法比小抑菌浓度法操作简便，结果清晰易读，成本较低，准确度较高，适合在不同临床实验室使用。

使用甲基-β-环糊精包合酮康唑不仅不会改变原药的抑菌能力，还可以增强其抗真菌效果，酮康唑原药的抑菌圈为（22.00±1.63） mm，酮康唑-甲基-β-环糊精包合物的抑菌圈则提升至（28.00±1.63） mm，表明酮康唑-甲基-β-环糊精包合物有更强的抑菌效果。通过最低抑菌浓度结果显示，酮康唑的最低抑菌浓度为（0.125±0.029） μg/mL，酮康唑-甲基-β-环糊精包合物的最低抑菌浓度为（0.062 5±0.015 0） μg/mL。

本试验结果为开发医疗新制剂及其在临床中的应用提供了试验基础，新剂型的研究优点是增强药物的疗效，延长作用时间，减少不良反应，还能保持药效的稳定，提高其抑菌效果，减轻局部刺激。因此，研究新剂型并拓展其在临床应用中的范围具有重要意义。

参考文献

[1] 于翔. 家畜真菌皮肤病的诊断和防控[J]. 畜牧兽医科技信息， 2020(1)：63.

[2] 方婷婷， 何伊能， 王慧， 浅部真菌病治疗中存在的问题及中医治疗对策[J]. 中国真菌学杂志， 2023，18(1)：38-41.

[3] 霍红霞. 口服氟康唑与酮康唑治疗阴道念珠菌病疗效及安全性对比[J]. 临床医学研究与实践， 2017，2(22)：57-58.

[4] 王曦悦， 刘润松， 仲华， 新型抗真菌药物研发的现状及未来[J]. 中南药学， 2023，21(6)：1403-1411.

[5] 赵运英， 曹正锋， 曹春蕾. 酿酒酵母中对抗真菌药物酮康唑敏感的突变菌株的筛选[J]. 基因组学与应用生物学， 2020(7)：3093-3102.

[6] SORINA D, ADIANA G F, REMUS M, et al. Ketoconazole-p aminobenzoic cocrystal, an improved antimycotic drug formulation, does not induce skin sensitization on the skin of BALBc mice.[J]. Inflammopharmacology, 2021, 29(3):1-13.

[7] 马井彪. 酮康唑对犬真菌性皮肤病的疗效观察[J]. 畜禽业， 2019，30(9)：110.

[8] YUTA A, YASUNORI I, YOSHIO M, et al. Efficient drug loading method for poorly water-soluble drug into bicelles through passive diffusion. [J]. Molecular pharmaceutics, 2023, 20(11):5701-5713.

[9] 卓敏， 严忠海， 张加慧. 环糊精及其衍生物在药学应用中的安全性综述[J]. 转化医学电子杂志， 2017，4(6)：77-83.

[10] 朱士龙， 李勇， 林红卫， 青藤碱-环糊精包合工艺的优化及包合常数测定[J]. 食品科学， 2012，33(8)：54-59.

[11] 徐徉. 2%酮康唑乳膏、2%硝酸舍他康唑乳膏、1%联苯苄唑乳膏的体外抗真菌活性研究[D]. 长春： 吉林大学， 2012.

[12] 李海波. 抗真菌药酮康唑中间体的合成工艺的研究[D]. 成都： 四川大学， 2006.

[13] 白婷， 杨蕊， 朱琳， 三唑类抗真菌药物致急性胰腺炎不良反应文献分析[J]. 现代药物与临床， 2022(6)：1389-1393.

[14] 洪阳， 叶琳， 周晓倩， 咪唑类抗真菌药物所致药物性肝病11例临床分析[J]. 肝脏， 2008(4)：354.DOI:10.14000/j.cnki.issn.1008-1704.2008.04.038 .

[15] 蒋川. 硝苯地平固体分散体的红外光谱/化学计量学表征研究[D]. 南京： 南京师范大学， 2015.

[16] 范林宏， 范文翔， 韦志强， 近红外光谱技术结合化学计量学在中药分析中的应用现状[J]. 中国实验方剂学杂志， 2019，25(24)：205-210.