超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱检测饲料中异噻唑啉酮

Determination of isothiazolinone in feed with ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry

摘要

目的 筛查并确证不在饲料常规检测范围、完全未知的新型非法添加物异噻唑啉酮。 方法 样品经酸性乙腈提取后稀释，利用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪测定。依据农业农村部第312号公告（2020年）规范性要求，对照采集的全扫描及二级扫描数据筛查并确证非目标物。 结果 确证饲料中非法添加异噻唑啉酮药物，并检测出药物质量分数为0.76%。 结论 本研究在饲料领域检出异噻唑啉酮工业杀菌剂非法添加的潜在风险，筛查与确证的思路和方法具有可推广性的借鉴意义。

关键词

异噻唑啉酮 / 超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱 / 杀菌剂 / 饲料安全 / 筛查 / 确证

Key words

isothiazolinone / ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry (UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS) / fungicide / feed safety / screening / confirmation

异噻唑啉酮杀菌剂（isothiazolinone，CIT）是一种常用的工业杀菌剂，在玩具^[1]、化妆品^[2-3]、纸制品^[4-6]、涂料^[7-8]、洗涤剂^[9]、纺织品^[10]、皮革^[11]等生产中被广泛应用^[12]，但异噻唑啉酮类化合物会刺激皮肤，使其敏感，甚至部分还会造成急性中毒^[13-14]，因此我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)^[15]虽将异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮规定为准用物质，但也限定了其最大允许含量为0.001 5%；食品接触类纸制品中也规定了该杀菌剂的使用限量^[16]。

然而在饲料领域，《中国兽药典》（2020版）或《食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）均未包含该类杀菌剂，因此在饲料中如有检出即属于存在非法添加情况。目前，异噻唑啉酮类药物用于动物的研究及检测技术近乎空白，因此在饲料“停抗”大背景下，此类非法添加情况会使得畜禽产品质量安全的风险加大。

促生长类药物饲料添加剂于2020年1月1日全面“停用”^[17]，2020年7月3日《饲料中风险物质的筛查与确认导则 液相色谱–高分辨质谱法（LC-HRMS）》（以下简称“《导则》”）标准发布并实施（农业农村部第312号公告）^[18]。《导则》从筛查准备、筛查流程、结果表述等方面作出了指导性规范^[19]。但是如何将《导则》的规范性要求应用于实际样品的具体检测，就需要结合样品实际情况建立可靠的检测方法，开展目标物和非目标物的筛查与确证。

本文依据《导则》中筛查和确认的程序与要求，建立具有可操作性的高分辨质谱的筛查和确认步骤，筛查并确认饲料中不在常规检测范围内的、完全未知的非法添加物风险。本研究为具体运用《导则》开展饲料中风险物质的筛查与确认提供技术参考，并及时发现减抗背景下饲料中新型非法添加物的潜在风险，为后续新型非法添加物的系列检测技术方法的发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Q Exactive型超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱质谱仪（美国Thermo公司）；异噻唑啉酮（isothiazolinone，CIT，美国First Standard公司）；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，美国Merck公司）。

1.2 标准溶液配制

称取异噻唑啉酮标准品10 mg于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容得到1 mg/mL标准储备溶液。

准确移取标准储备溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容配制100 μg/mL标准中间溶液，采用0.1%甲酸溶液稀释定容标准中间溶液，配制浓度为1 μg/mL标准溶液。

1.3 样品前处理

称取饲料样品2 g，加入20 mL 0.1 mol/L盐酸-乙腈溶液（体积比为1:1），振荡提取10 min，9 000 r/min离心5 min。准确移取100 μL上层清液于离心管中，加入900 μL 0.1%甲酸溶液，涡旋混匀后通过0.22 μm滤膜待测。

1.4 色谱条件

C18色谱柱：100 mm×3.0 mm×1.8 μm；流动相：A为乙腈-甲醇（1:3，V/V），B为0.1%甲酸溶液，梯度洗脱程序见表1；柱温：30 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL。

1.5 质谱条件

设置325 ℃为离子传输管温度；正、负离子切换模式下，3.2 kV毛细管电压；350 ℃的汽化温度；70 000分辨率（R）；扫描模式使用Full scan + dd MS²（一级全扫描m/z范围设为100~1 200）；碰撞能量选用20、40、60 eV；碰撞阈值设为5 000。

1.6 样品

抽自饲料市场的1份成分未知的饲料样品，样品置于-18 ℃以下冷冻保存，备用。

2 结果与分析

2.1 前处理过程的确定

面对饲料中未知的非目标物筛查时，需要将前处理方法简化，尽量保留所有可能存在的药物，减少其损失。因此，本方法选取了同时含有有机相、无机相的提取溶剂（0.1 mol/L盐酸-乙腈溶液，体积比为1∶1），在未知物筛查时可以保证各药物最大程度的提取效率。

2.2 异噻唑啉酮（CIT）的筛查与确认

依据《导则》先通过自建的目标化合物谱库搜索，除常见的维生素外，并未发现其他非法添加物。但样品的正离子扫描模式下的总离子流图（图1A）中可以看出保留时间在7.06 min处有明显的未知物色谱峰。

根据《导则》中“非目标物的筛选与确证”要求，化合物的推断需要通过提取离子流色谱（EIC）图、一级全扫描质谱图、精确质荷比以及同位素峰的相对离子丰度比等信息，获取非目标物的精确质量数信息，从而可以推断出元素组成与分子式，再对该分子式进行检索就可以推断可能的化合物。

通过提取正离子扫描模式下出峰时间为7.06 min处不同质核比的响应情况，发现存在质核比（m/z）为149.977 25的物质。进一步考察该物质的同位素峰情况，发现存在M+2特征同位素峰151.973 98，且同位素峰响应比M∶（M+2）近乎为3∶1，推断符合含有1个氯元素的特征。

结合保留时间、氮律、得分、化合物响应、理论与实测同位素丰度比等因素理论拟合出3种可能性较高的化合物，分别为C₄H₄ClNOS、C₃H₄N₃ClS、C₅H₈NClS。借助同位素丰度比和Chemspider等网络手段对比，初步筛查出保留时间为7.06 min处的化合物可能为异噻唑啉酮（C₄H₄ClNOS, CIT）。

依据《导则》规定的程序，使用1 μg/mL相应的参考标准品，按目标物确认要求进行确认。经过比对保留时间（图1）、同位素峰（图2）以及二级碎片质谱图（图3），发现二者完全匹配，完全满足《导则》中的要求，因此确认检出异噻唑啉酮药物（CIT）。

2.3 假阴性率与检出限

根据FDA-SANTE /11813 /2017，在20个平行样品中各添加100 mg/kg异噻唑啉酮，经检测发现均可检出，假阴性率＜5%。因此，异噻唑啉酮的筛查检出限为100 mg/kg，且能满足药物实际检出含量需求。

2.4 实际样品检测结果

经过超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱质谱检测，参照《导则》规定程序及要求，筛查并确认了饲料样品中存在异噻唑啉酮的非法添加，属于工业用新型杀菌剂。经过与标准品比对定量分析发现，样品中异噻唑啉酮药物含量为7 600 mg/kg，即质量分数为0.76%。

3 结论

异噻唑啉酮类药物作为工业杀菌剂，并不在饲料领域常规目标物监测项目及化合物数据谱库中。未知非目标化合物的筛查和确认工作一直是检测分析工作的难点。本试验应用高灵敏度的高分辨质谱仪器作为检测手段，参照《导则》规范程序和判定要求筛查并确认了饲料中异噻唑啉酮类新型非法添加物。本研究是《导则》具体而成功的1次实践和应用，为后续开展饲料中风险物质的筛查与确认提供技术参考。异噻唑啉酮类杀菌剂在饲料质量安全监测中的检出，表明在“减抗”养殖监控下有违法添加农用或工业用新型抗菌抑菌剂的趋势，也为饲料“停抗”时代下的绿色健康养殖规范敲响警钟。

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[19] 中华人民共和国农业农村部. 饲料中风险物质的筛查与确认导则 液相色谱-高分辨质谱法（LC-HRMS） 非书资料: 中华人民共和国农业部公告第312号[S]. 北京, 中华人民共和国农业农村部, 2020: 7.

基金资助

上海市科技兴农项目(沪农科推字（2020）第1-4号)