基于cBD3的衍生肽对犬皮肤源多药耐药菌的抑菌活性

Antibacterial activity of derivative peptide based on cBD3 against multidrug resistant bacteria from canine skin

摘要

目的 筛选犬皮肤源多药耐药菌，同时基于犬防御素设计衍生肽并探究其抗菌作用。 方法 通过K-B药敏纸片法对临床分离的菌株进行筛选，随后以犬β-防御素3（cBD3）的氨基酸序列为模板，采用氨基酸替换的方式对序列进行设计，选取优化肽cBD3-ABU进行化学合成，利用微量肉汤稀释法检测cBD3-ABU对多药耐药菌的抑菌活性。 结果 筛选获得8株犬皮肤源多药耐药菌；通过固相合成法获得纯度达95.61%的cBD3-ABU；cBD3对大肠杆菌、表皮葡萄球菌、伪中间型葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为32、64、64、128 μg/mL，高浓度cBD3-ABU对犬皮肤源大肠杆菌、表皮葡萄球菌、伪中间型葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为96.02%、81.85%、87.25%、98.91%。 结论 cBD3-ABU在体外具有良好的抑菌活性，具有进一步开发为治疗性药物的潜力。

关键词

犬β防御素-3 / 多药耐药菌 / 最小抑菌浓度 / 抑菌活性 / 耐药率

Key words

canine β-defensin-3 (cBD3) / multidrug resistant bacteria / minimum inhibitory concentrations (MIC) / antibacterial activity / drug resistance rate

多药耐药菌（multidrug-resistant organism, MDRO）是指对3类及3类以上抗菌药物同时耐药的病原菌。预防和控制多药耐药菌已经成为世界公共卫生问题，因此亟需寻找和开发新的抗菌药物，而抗菌肽是目前最具有应用前景的新型抗菌药物。抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）作为生物先天免疫系统的重要组成部分，具有广谱抗菌活性，能杀死抗生素耐药菌株^[1]，且不易产生耐药性突变的特点。防御素（Defensin）是抗菌肽家族中最大的亚族，根据防御素空间结构不同可将其分为α-、β-和θ- 3个亚家族^[2]。其中，β-防御素是一类富含精氨酸的低分子阳离子内源性抗菌肽^[3]。

犬正在成为研究β防御素的潜在模型。早期研究表明，犬β防御素基因cBD1、cBD102、cBD103、cBD122以及cBD124在皮肤组织中广泛表达，而cBD103对犬皮肤常见细菌有一定抑制效果，与正常犬相比患有特应性皮炎的犬皮肤中cBD103及cBD122的转录水平明显降低，因此推测cBD122同样具有良好的抗菌效果^[4]。基因cBD122经转录和翻译成为3种亚型cBD1（AY169790）、cBD2（AY169791）和cBD3（AY169792）。通过序列可知3种亚型都有1个相同的249 bp的5′端序列，包括5′端非翻译区（untranslated region, UTR）和不受终止密码子干扰的阅读框（open reading frame, ORF）。然而，在3′端序列上的异构体是多样的，包括cBD2和cBD3的3′-UTR和部分ORF^[5]。

与另外2个亚型相比，cBD3的C端出现了扩展可以保护肽免受降解。本研究选择稳定性更好的cBD3作为试验材料。cBD3（氨基酸序列KCWNLRGSCREKCIKNEKLYIFCTSGKLCCLKPK）由Cys9-Glu11、Ile21-Cys23和Leu28-Cys30组成，在N端附近有1个短的螺旋段（Trp3-Arg6）和3个反平行β片链，这与之前报道的hBD3（人类β-防御素）结构一致^[5]。Rodrigues等^[9]对犬基因组进行了计算分析，证明犬基因组编码了43个β-防御素基因和伪基因，且与人类和小鼠的β-防御素基因相似。根据序列比较，hBD3和cBD3似乎是同源基因。全长hBD3有3对天然二硫键（Cys11-Cys40，Cys18-Cys33和Cys23-Cys41），基于人β-防御素预测了cBD具有Cys2-Cys29，Cys9-Cys23和Cys13-Cys30的结构。二硫键的存在对β防御素的抗菌作用具有微小的影响^[18-19]，二硫键成环是造成cBD3难以合成及价格高昂的主要原因。

本研究对犬体表皮肤分离的细菌进行药物敏感性试验，优化新型防御素，测试优化后的防御素对多药耐药菌的作用，以期改变肽链氨基酸顺序和蛋白质空间结构，进而增强抗菌活性，降低合成成本，为新型抗生素的开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1）菌株。本研究所用26株菌系实验室自2014年12月至2015年12月储备，共从63例犬细菌性皮肤病病料中分离得到98株致病菌中成功复苏，其中有革兰氏阳性菌中的伪中间型葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、金黄色葡萄球菌，革兰氏阴性菌中的短小芽孢杆菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌。大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli, ATCC 25922）由本实验室鉴定保存。

2）抗菌肽。cBD-ABU短肽由戴安生物有限公司采用固相合成，纯度95.61%，其氨基酸序列为KαWNLRGSαREKαIKNEKLYIFαTSGKLααLKPK。5 mg cBD3-ABU储存于-20 ℃低温冰箱，使用前通过无菌水溶解。

3）主要试剂。LB（Luria bertani)琼脂培养基、LB液体培养基、TSA(Tryptic soy agar)琼脂培养基、TSB(Tryptic soy broth)液体培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司；药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。

4）主要仪器。恒温培养箱（DNP-9162），上海右一仪器有限公司；培英恒温振荡器，苏州市培英实验设备有限公司；洁净工作台（DL-CJ-2ND1），北京东联哈尔仪器制造有限公司；高压蒸汽灭菌锅（G154DWS），武汉递热爱生物科技有限公司；生物显微镜（N-300M），河南兄弟仪器设备有限公司；超低温冰箱（AUCMA），武汉递热爱生物科技有限公司；数显恒温水浴锅（HH-6），国华电器有限公司；离心机（5417R），Eppendorf公司。

1.2 方法

1）犬防御素的优化。α氨基丁酸作为一种重要的化工原料和医药中间体，常用于合成多肽或模拟肽和保护氨基酸单体。本试验用α氨基丁酸（α-Aminobutyric acid, ABU）取代半胱氨酸残基，以cBD3为母体肽，在犬防御素cBD（canine beta-defensin, cBD）的氨基酸序列基础上进行优化，采用ABU取代半胱氨酸残基，使肽在化学上不活跃，但具有较强的抗菌活性。

2）药敏试验。根据临床和实验室标准研究所指南，采用KB纸片扩散法测定每个菌株的药物敏感性。从过夜培养的TSA平板上挑取数个单菌落，置于4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的OD值为0.08，再用无菌拭子沾取悬液划线整个琼脂表面，将抗菌药物纸片贴于已接种细菌的琼脂表面。测定26株菌对10种抗菌药物的敏感性：环丙沙星（ciprofloxacin, CIP），氯霉素（chloramphenicol, C），庆大霉素（gentamicin, GM），四环素（tetracycline, E），克林霉素（clindamycin, CC），复方新诺明（paediatric compound sulfamethoxazole tablets, SXT），红霉素（erythromycin, E），头孢哌酮（cefoperazone, CTR），氨苄西林（ampicillin, AM），头孢唑林（cefazolin, CZ）。

3）平板菌落计数法。将待测样品稀释至10^-5、10^-6、10^-7 CFU/mL，取一定量的稀释样液涂布于平板上培养18 h，形成肉眼可见的菌落，统计菌落数，根据其稀释倍数可得到样品中的含菌数。

4）抗菌肽最小抑菌浓度的测定。最小抑菌浓度的测定在96孔板中进行，MH培养基为对照，做抗菌肽的二倍浓度梯度稀释，之后加入稀释到10^-5 CFU/mL的等量菌液，在恒温箱中培养24 h，用酶标仪检测每个孔的OD₆₀₀值。按下列公式计算抗菌肽的抑菌率^[21]：

抑菌率＝ \frac{\mathrm{阳性}\mathrm{对照}\mathrm{孔}\mathrm{O}\mathrm{D}-\mathrm{药物}\mathrm{孔}\mathrm{O}\mathrm{D}}{\mathrm{阳性}\mathrm{对照}\mathrm{孔}\mathrm{O}\mathrm{D}-\mathrm{阴性}\mathrm{对照}\mathrm{孔}\mathrm{O}\mathrm{D}}×100%

2 结果与分析

2.1 防御素优化结果

本试验用ABU取代半胱氨酸残基，得到序列为KαWNLRGSαREKαIKNEKLYIFαTSGKLααLKPK的cBD3-ABU，结构模型如图1所示，二硫键成环的结构被直链所代替。

电喷射质谱鉴定和高效液相色谱法纯化结果见图2、图3，质谱法能够准确测定有机物的分子量。计算的实际分子质量3 886.72 u与cBD3-ABU理论分子质量基本相符，表明此肽为cBD3-ABU（图2）。根据色谱图的出峰时间和峰面积进行定性定量分析，物质浓度和对应峰面积呈正比，且仅出现单峰，说明合成样品纯度较高（图3）。

2.2 药物敏感性

试验结果显示，16株菌至少对1种抗生素表现耐药。由表1可知，葡萄球菌分离株对红霉素耐药率最高（47.8%），其次是四环素（43.5%）。在26株菌中，有8株表现为多重耐药，多重耐药率达30.7%；在上述多耐菌株中，4株表现为3种抗生素耐药（50%, 4/8）。

2.3 cBD3-ABU对多药耐药菌的抑菌率

通过酶标仪测定各孔OD_{600 nm}值，计算各孔抑菌率，当抑菌率＞5%时，认定孔中所含溶剂对细菌的生长有影响。cBD3和cBD3-ABU的抑菌率见表2。大肠杆菌、表皮葡萄球菌、伪中间型葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）分别为32、64、64、128 μg/mL。高浓度（512 μg/mL）的cBD3-ABU对其中2株多药耐药菌的抑菌率达到了90%以上，抑菌率随浓度的降低迅速下降。

与球菌相比，cBD3-ABU对大肠杆菌的抑菌率随浓度降低而下降的趋势一致，故选取大肠杆菌ATCC25922进行试验，结果见图4。CBD3-ABU对临床分离的多药耐药大肠杆菌的作用效果与其对标准控制菌株的作用效果差异显著。cBD3-ABU对多药耐药菌在体外有直接抑制作用，该作用与cBD3-ABU浓度呈正相关。

3 讨论

犬细菌性皮肤病是由细菌感染（如葡萄球菌）引起，又称脓皮症。本研究团队自2015年留存菌株中共成功复苏26株菌，以葡萄球菌和肠杆菌为主，其中葡萄球菌中的伪中间型葡萄球菌的检出率最高。为从成功复苏的菌株中筛选出多药耐药菌，本研究选择MIC法和KB法，上述2种方法是目前CLSI推荐的2种检测肠道菌对药物敏感性的标准方法，KB纸片法操作过程简单，适合筛选大量菌株。所有复苏菌株中，8株为多药耐药菌株，多重耐药率达到30.7%。cBD的MIC试验结果与Sang等^[5]的研究结果相符。cBD3-ABU对本试验分离的不同种类菌株均表现为抑制作用，表明其具有广谱抗菌性。本研究仅针对体外抑菌活性，评价cBD3-ABU在动物体内人兽共患病皮肤病感染的治疗效果，但cBD3-ABU成为治疗性药物的安全性需要进一步研究。

β-防御素在皮肤防御中发挥重要作用^[10]。据报道^[15]，β-防御素的截短肽具有有效的抗菌活性。因为MIC法的敏感性和可定量性良好，在cBD3-ABU体外抑菌活性检测试验中选择采用MIC法，本研究结果证明了cBD3-ABU对多药耐药菌有抑菌作用，表现剂量依赖性。高剂量时抑菌率随浓度降低而下降，但在质量浓度低于16 μg/mL曲线出现了偏差，不排除由于浓度低而出现误差。据报道^[5]，以3种异构体保守的成熟肽区域相对应的34个氨基酸序列作为模版合成的cBD对大肠杆菌的MIC为50 μg/mL，cBD3-ABU与该以原始氨基酸序列为模版合成的cBD有不小的差距，可能是序列在表达的过程中影响了与活性相关的结构，因此提高抗菌肽活性是下一步研究的重点。

目前，人们普遍认为抗菌肽能够特异地选择作用位点或细胞成分，通过降解细菌脂多糖、真菌细胞膜磷脂和鞘脂等导致病原体死亡。cBD3作用机制研究刚起步，其可能存在更加丰富的抗菌机制。cBD3-ABU作为犬的天然防御素的优化短肽，理论上不会产生耐药性的风险。因此，cBD3-ABU作为1种广谱性抗菌肽在预防和治疗动物传染病中有良好的应用前景，通过进一步改造具有部分替代抗生素的可能性。关于cBD3-ABU的进一步应用还存在一些制约因素，如剂量依赖性和体外高效表达问题等。

4 结论

多药耐药菌在临床普遍存在，本研究中多药耐药菌的检出率高达30.7%。犬抗菌肽优化序列cBD3-ABU有一定的抗菌活性，可抑制大肠杆菌ATCC25922和多药耐药菌的生长繁殖。犬抗菌肽优化序列cBD3-ABU具备开发新型抗多药耐药菌药物的潜力，可作为新型抗菌药物进一步深入研究。

参考文献

[1] 卢顺， 向敏， 高其双， 哺乳动物防御素生物学研究进展[J]. 中国兽医杂志， 2014，50（2）：61-64.

[2] GANZ T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity[J]. Nat. Rev. Immunol, 2003, 3: 710-720.

[3] 刘陶林， 张宜宸， 何季竺， 狐β-防御素基因的组织分布及表达特性[J]. 中国兽医杂志， 2021，57（3）：36-40.

[4] LANCTO C A, TORRES S M, HENDRICKSON J A, et al. Altered expression of antimicrobial peptide genes in the skin of dogs with atopic dermatitis and other inflammatory skin conditions[J]. Vet Dermatol, 2013, 24(4): 414-21.

[5] SANG Y, ORTEGA M T, BLECHA F, et al. Molecular cloning and characterization of three beta-defensins from canine testes[J]. Infection & immunity, 2005, 73(5): 2611-2620.

[6] 徐海涛. 猪β-防御素-2的重组表达及体外抑菌和抗病毒试验研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2009.

[7] SANTORO D, BUNICK D, GRAVES T K, et al. Expression and distribution of antimicrobial peptides in the skin of healthy beagles[J]. Vet Dermatol, 2011, 22(1): 61-67.

[8] VAN DAMME C M, WILLEMSE T, VAN DIJK A, et al. Altered cutaneous expression of beta-defensins in dogs with atopic dermatitis[J]. Mol Immunol, 2009, 46(13): 2449-2455.

[9] RODRIGUES HOFFMANN A, PATTERSON AP, DIESEL A, et al. The skin microbiome in healthy and allergic dogs[J/OL]. PLoS one, 2014, 9(1): e83197[2024-02-04].

[10] LEONARD B C, MARKS S L, OUTERBRIDGE C A, et al. Activity, expression and genetic variation of canine β-defensin 103: a multifunctional antimicrobial peptide in the skin of domestic dogs[J]. Innate immun, 2012, 4(3): 248-259.

[11] CHERMPRAPAI S, EDERVEEN THA, BROERE F, et al. The bacterial and fungal microbiome of the skin of healthy dogs and dogs with atopic dermatitis and the impact of topical antimicrobial therapy, an exploratory study[J]. Vet Microbiol, 2019, 229: 90-99.

[12] 朱永官， 欧阳纬莹， 吴楠， 抗生素耐药性的来源与控制对策[J]. 中国科学院院刊， 2015，30（4）：509-516.

[13] 薛占永， 刘伟， 张宁宁， 犬细菌性皮肤病病原菌的分离鉴定与药敏试验[J]. 中国兽医杂志， 2008，44（12）：57-58.

[14] 苏梦茹， 马培培， 李鑫鑫， 9种抗菌药物对大肠埃希菌最小抑菌浓度的测定[J]. 动物医学进展， 2020，41（3）：52-56.

[15] 赵国春， 扣泽华， 孔令聪， β-防御素生理特性的研究进展[J]. 当代畜禽养殖业， 2020，10：17-20.

[16] 邱晓媛， 郭广振， 吴鹏鑫， 防御素的生物学功能及其在畜牧业的应用研究进展[J]. 动物营养学报， 2022，7：1-6.

[17] 任艳蓉， 李传峰， 孟春春， 犬β防御CBD122原核表达及其抗病毒活性研究[J]. 中国动物传染病学， 2022，7：1-11.

[18] KLÜVER E, SCHULZ-MARONDE S, SCHEID S, et al. Structure-activity relation of human beta-defensin 3: influence of disulfide bonds and cysteine substitution on antimicrobial activity and cytotoxicity[J]. Biochemistry, 2005, 44(28): 9804-9816.

[19] BASTOS P, TRINDADE F, COSTA J DA, et al. Human antimicrobial peptides in bodily fluids: current knowledge and therapeutic perspectives in the postantibiotic era[J]. Med Res Rev, 2018, 38(1): 101-146.

[20] 王宇光， 叶秋娟， 吴冬梅， 生物催化法水解制备N-BOC-L-α-氨基丁酸[J]. 发酵科技通讯， 2016，45（3）：129-132.

基金资助

华中农业大学大学生科技创新基金(2021067)

华中农业大学“名师工作室”培育项目