随着国民经济的不断发展及人民生活水平的提高，羊肉在国民饮食中的需求日益增加。然而，由于羊肉出肉量少，无法满足较高的市场需求，导致市场上的羊肉价格不断上涨。因此，为了提高国民的健康水平和生活质量，增加羊肉的产量显得尤为重要。提高山羊养殖业产出效率的关键之一就是从育种阶段提高效率。为此，人工授精在山羊育种中的应用日益普及。人工授精是目前应用最广泛的现代辅助生殖技术之一，极大地促进了现代畜牧业的规模化和集约化发展
[1]。家畜精液的保存能够突破牲畜繁殖的时间和地域限制，有利于加快牲畜遗传改良进程，保护牲畜种质资源和遗传多样性
[2]。需要注意的是，人工授精的成功很大程度上取决于保存精液的质量，这是影响其有效性的关键因素
[3]。精液冷冻保存技术是目前有效保存精液的主要方法，该技术通过对精液进行特定处理，使精子的功能、超微结构和生化特性在相应的环境中得以较好地保存
[4]。因此，研究山羊的精液冷冻技术对精液的保存具有重要而积极的意义，对家畜养殖业的发展至关重要。然而，与其他牲畜的精液保存技术相比，目前对于山羊精液保存的研究较少，技术尚不成熟。鉴于此，系统研究山羊精液在冷冻状态下的特性对山羊规模化高效养殖尤为重要。
1 山羊精液的基本特点
山羊精液由精清和精子构成。成年公羊的睾丸重量在120～150 g，1次射精量可达0.8～2.0 mL。精液密度约为20亿～30亿/mL，新鲜精液呈乳白色或浅乳黄色，无异味，pH值为6.1～7.3。精子浓度越高，乳白色程度越明显。精子呈云雾状，活动方式包括直线前进、回旋运动和摆动，其中直线运动的精子量超过60%可供输精使用。
山羊精子可分为头、颈和尾3部分，属于单倍体细胞。其总长度约为50～70 μm。
图1为山羊精子的外观形态示意图，精子头部呈椭圆形，由细胞核和核前顶体组成。窄头、巨头、头发育不全以及顶体脱落等头部畸形都不利于卵子受精。精子颈部是其最脆弱的部分，容易导致尾部脱离。而精子尾部由轴丝、细胞膜、线粒体鞘和纤维组成。中段卷曲、双尾、线粒体鞘脱落以及尾部缺失等都属于头部畸形表现。山羊受精时精子会发生获能反应和顶体反应。精子获能后与母羊的卵母细胞发生联系，进而在顶体的作用下进入卵母细胞。精子头部的顶体能穿透卵母细胞的透明带，从而实现受精
[5-6]。
2 精液冷冻保存原理
根据保存温度，精液保存方法可分为3种：常温保存（15～25 ℃）、低温保存（0～5 ℃）和冷冻保存（-79 ℃或-196 ℃）。精液冷冻保存是以干冰（-79 ℃）或液氮（-196 ℃）为冷源，将处理后的精液冻结成固态以长期保存。在新鲜精子中，活动精子的百分比为94.7%，而在冻融精液中下降到64.2%
[7]。这是由于在冷冻过程中，精液细胞外液首先结晶形成渗透压，导致精液细胞内部水分向外迁移，最终导致细胞脱水和皱缩。细胞脱水会使蛋白质分子间距缩短，从而导致细胞发生变性
[8-10]。冷冻速率越慢，精液细胞内冰晶形成越多，细胞器更容易受损。
图2为冷冻对精子微结构的影响。如
图2所示，在冷冻-解冻过程中，精子顶体外膜会发生断裂和脱落，从而降低了精子的活力。
3 精液冷冻保存技术的影响因素
3.1 精清
精清主要由公羊的前列腺、精囊腺、尿道球腺和附睾产生
[12]。公羊生殖器射出的精子首先浸泡在具有营养作用的精液浆中，即精清。精清中含有水、果糖、蛋白质、多肽、酶类、无机盐和有机小分子，对精子起到营养和调节作用。已有研究证实精液中存在对母畜生殖道信号传递的信号因子，如前列腺素PGE
2、生长转换因子TGF-β
[13]。当精子到达母羊子宫后，由于信号因子的传递作用，会降低子宫收缩和敏感生殖道带来的不良反应
[14]。然而，精清的存在也会对低温冷冻保存带来不利的影响。刘冰等
[15]发现去除精清可使精子免受低温保存的损伤。Akcay等
[16]进一步发现冷冻精液前降低精清浓度可维护精子的能动性。去除精清可避免其内部的脂肪酶对精子活力的不利影响
[17]。此外，精清中Fe
2+对冷冻精子也会产生毒害作用
[18]。为了增加解冻后精子的受胎率和减少精清的毒害作用，许多研究员利用单层梯度离心技术去除精液中5%～10%的精液。值得注意的是，离心过程中的离心力、离心稀释液和离心时间是影响精子活力的重要因素
[19]。
然而，也有相关专家和学者提出相对立的观点，认为精清保留在冷冻精液中能对精子起到保护作用，提高精子存活率。屈治泉等
[20]通过检测FOXP3
-特殊转录因子表达量，发现精清的缺失会导致CD4+CD25+T调节性细胞数量减少，从而增加母畜疫病发生率，降低繁殖能力。陈志林等
[21]也表明精清能改变精子表面的蛋白构象，改善精子质膜的通透性，便于精子内遗传物质进入卵细胞。因此，目前关于精清对精子的影响机理尚未明确，应根据具体试验现象全方位多角度地分析冷冻保存时精清的去除与否。
3.2 稀释液
冷冻精子的稀释液不仅用于扩大精液体积、防止精子冷应激，还提供营养并作为高pH的缓冲液，以延长精子的存活时间。一般而言，冷冻稀释液由营养物质、冷冻保护剂、缓冲物质和抗生素等组成
[22]。不同类型的稀释液对冷冻精液解冻后的精子活力存在明显影响。王俊峰
[23]发现柠檬酸钠溶液可以作为冷冻稀释液的缓冲物质。施会彬等
[24]和李会玲等
[25]也表明柠檬酸钠能稳定精液的pH，降低精子的酸损伤，从而保护精子品质。抗生素的使用则能调节精子膜内部的钙离子稳定性，保护精子细胞膜的完整度
[26]。同时，抗生素还能抑制精液中的细菌生长（如大肠杆菌），延长精子的保存时间
[27]。Pruskae等
[28]在试验中证实抗生素与冷冻保护剂能协同作用以保护精子活力。卵黄作为最有效且应用最广的稀释液成分之一，因为其中含有许多类脂
[29]。含有类脂或磷脂的稀释液在冷冻过程中能降低精子膜的损伤，磷脂能替代冷冻过程中精子膜的丢失磷脂，并加强精子膜调节离子、蛋白质和ATP流动性的能力，从而保持精子成活率
[30]。
3.3 冷冻保护剂
冷冻保护剂的选择对山羊精液低温冷冻保存技术的成功与否至关重要。
表1展示了常用的冷冻保护剂及其作用机制。冷冻保存剂主要分为四大类，包括多糖、多酚化合物、有机化合物以及抗氧化剂。基于卵黄稀释液的成功应用，许多糖类或类脂调节剂被用来制作稀释液，以减少精子冷冻过程中的损伤。此外，氧损伤是降低精液质量的重要因素，在冷冻过程中受到稀释平衡、渗透压变化、冷休克和酶作用的影响，导致精子细胞中大量活性氧（ROS）产生聚集，影响解冻后精液的质量
[31]。大量研究表明
[32-36]，过量ROS诱导的氧化应激被认为是冻融精子冷冻损伤的主要原因，氧化应激会损害精子细胞膜、DNA完整性、氧化稳态、精子-卵母细胞融合、活力和活性。因此，在冷冻稀释液中可以添加抗氧化剂以保护精子免受ROS的影响。
3.4 精液冷冻保存程序
精子冷冻保存技术包括冷却和冷冻2个关键阶段，平均耗时为8～10 h。冷却阶段包括精子的收集和稀释。
图3为山羊冷冻精液的制作流程。
首先，通过离心机去除精清，然后在5 ℃下冷却2 h以调整精子在冷冻前膜的相变。
其次，加入冷冻保护剂并使之与精子充分接触，之后包装冷冻，冷冻速率调至冰晶和甘油达到最佳水平下。最后精子被保存在液氮中（-196 ℃）。
此外，液氮存储容易增加精子细胞内的ROS水平，减少低温保存精液的寿命
[48]。
Junwei等
[49]分别评估了液氮储存2、4和8年的精液质量，发现4年和8年的冷冻精液总精子活力略有下降。
3.5 精液解冻
解冻会使精子再次受到二次结晶化损伤，快速解冻能降低精子受损并促使精子复苏。但解冻速率控制不当易造成精子复苏后死亡数增加
[50]。合适的解冻温度和时间促使精液快速通过危险温度区（-60～0 ℃）并缓慢经过“冷休克”温区（0～5 ℃）
[51]。解冻时间对精子活力有负面影响。目前山羊冻精常用的解冻方法有2种：一种为半干解冻，将精液管置于在35～40 ℃的恒温水浴中浸泡10～15 s
[52-53]。另一种解冻方法为干解冻，将解冻液注入精液管中，然后置于70～80 ℃热水中
[54]。目前山羊的精液冷冻常用塑料细管包装（体积0.25～5.00 mL），这有利于精子温度与外界温度同步，尤其是小型细管更有利于精液保存。
4 应用山羊精液低温冷冻技术的优势与待改进的地方
4.1 应用山羊精液低温冷冻技术的优势
山羊精液冷冻保存的最大优势在于延长了精液的使用期限。新鲜精液在常温下只能在1 d内使用，而冷冻处理后的精液可无限期保存。
第一，山羊自然交配的公母最佳比例为1∶10，而人工授精则为1∶50。从经济效益上看，山羊精液冷冻保存可以降低引种和饲养成本。冷冻精液选用优良基因种羊作为冷冻源，与鲜精相比，可提升养殖企业30%以上的遗传效益，并降低80%的引种及饲养成本。
第二，冷冻精液是保种育种的重要手段。冷冻精液可以延长种羊遗传物质的使用时间，避免受到种羊死亡等限制，以及公母羊自然交配互相感染并传染的各种疾病（例如弧菌病、毛滴虫病）。山羊冷冻精液在保留和恢复精液供应、血统更新和疫病防治等方面具有重要意义。
第三，冷冻精液技术实现了优良种羊精液长距离和长时间运输，降低了运输成本，可跨国、跨地区流通。
4.2 待改进的地方及其建议
山羊精子对低温较为敏感，冷冻-解冻过程中通常会导致40%～50%的精子死亡。因此，必须采取有效措施提高山羊冷冻精液的效果。
第一，选择冷冻耐受精液。第二，优化冷冻保护剂。冷冻的关键在于合适冷冻保护剂的选择，山羊冷冻精液可考虑使用具有保护细胞膜、降低细胞内渗透压、抗氧化作用的冷冻保护剂。第三，优化精液冷冻-解冻程序。为了维持精子细胞结构的完整，需要选择精良的冷冻仪、合适的冷冻速率和解冻速率，减少对精子造成的不可逆损伤。
5 山羊冷冻精液与人工授精的结合应用
人工授精作为一项通过雄性基因优势来提高生产力的重要工具，在规范化自动化的山羊养殖业中得到了广泛应用。法国、爱尔兰、澳大利亚、新西兰等国家通过人工授精提高了绵羊和山羊的繁殖效率，这被证明是一种快速改良牲畜的有效方法
[55]。然而，用于人工授精的新鲜精液在时间和空间上有极大的限制。而冷冻精液的应用极大地改善了这一问题。冷冻精液使得山羊在一年中不同的时间段内都可以进行受精，无须购买公羊，从而降低了相关费用。Peruma
[8]研究表明公羊精液生产成本中，公羊的维护成本占53.69%，精液加工和保存的成本分别仅占33.38%和12.93%。Thirunacukkaras
[56]的研究也表明公羊的维护成本比例较高。因此，冷冻精液与人工授精相结合是未来发展的趋势。
冷冻精液人工授精的结合显著提高了羊群的繁殖效率。成年雌性山羊一般每年有1～2个发情季，每个季节发情1～2次，持续2～3 d。山羊的妊娠期为146～160 d，而季节性发情的山羊一年只繁殖1～2次，每胎通常产1～2只小山羊。由于受到温度、光照和其他因素的限制，体外授精的精液储存能力非常有限。人工授精提高了山羊受孕率（超过80%），从而提高了生殖效率。此外，农牧民常常使用外源激素诱导山羊发情，使羊群发情期基本一致，以缩短繁殖周期
[57]。
高效的人工授精对技术人员有很大的依赖性。因此，选择和培训技术娴熟的人工授精技术人员是降低成本的有效途径。授精次数越多，人工授精的成本越低。目前，人工授精的技术人员成本（8.18%）相对较高，可以通过最大程度地利用技能来使成本最小化或降低这一成本。
6 结语
山羊精液的特性使得传统的新鲜精液人工授精存在着较大的限制，包括空间、时间和成本等方面的限制。相比之下，低温冷冻保存技术为山羊精液人工授精的应用带来了巨大优势。这项技术不仅打破了时间和空间的限制，还能够优化授精质量，极大地促进山羊优良品种的繁育。在冷冻精液技术中，冷冻保护剂的选择和抗氧化剂的应用对于成功保存精液至关重要。
然而，与新鲜精液相比，冷冻精液仍然存在一些问题有待克服。首先，冻精的精子活力、生存指数和顶体完整率相比新鲜精液有所降低。此外，冷冻保护剂的选择需要因地制宜，适应山羊精液的特性。其次，当前用于制备冷冻精液的精密冷冻仪数量仍然不足，需要进一步降低冷冻设备的研发成本。最后，国家尚未制定针对山羊冻精的生产技术标准，迫切需要完善相关技术标准及法规。
总之，建议对冷冻山羊精液过程中产生的物理、化学、渗透及氧损伤进行深入研究，研发高效冷冻保护剂，并建立规范的冷冻-解冻工艺，以提高山羊冻精的品质。
京公网安备11010202008535号
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