四川省西昌市中小规模猪场圆环病毒Ⅱ型定殖情况调查与分析

Preliminary investigation and analysis on the colonization of cyclovirus (type Ⅱ) in small-scale and medium-scale pig farms in Xichang City, Sichuan Province

摘要

目的 了解猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）在四川省西昌市中小规模生猪养殖场中的流行情况，为制订综合防控策略提供依据。 方法 查阅中国知网数据库2012年以来有关西昌市PCV2流行病学监测的文献资料，分析PCV2的流行趋势。2023年5—9月，对西昌市部分中小规模生猪养殖场进行了生猪养殖现状调查，采用PCR检测方法对环境拭子进行圆环病毒Ⅱ型检测。 结果 文献资料显示，西昌市2008—2019年PCV2感染情况严重。检测结果显示，西昌市中小规模生猪养殖场圆环病毒Ⅱ型的环境定殖率为17.91%，环境易传播时间在6月和9月，规模较大的养猪场对环境安全的控制措施较好，通过氢氧化钠等进行环境消毒可以做好猪圆环病毒Ⅱ型的防控。 结论 西昌市圆环病毒Ⅱ型在环境中定殖情况较严重，动物疫病预防控制机构和生猪养殖者需有针对性地制定综合防控策略。

关键词

生猪养殖场 / 圆环病毒Ⅱ型 / 环境拭子 / 定殖 / 流行病学监测

Key words

pig farms / cyclovirus (type Ⅱ) / environmental swab / colonization / epidemiological monitoring

猪圆环病毒病是由圆环病毒（porcinecircovirus，PCV）感染后引起的一类疾病，各日龄和品种猪均可发生，其中仔猪和母猪受到的危害严重。PCV可分为猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）及猪圆环病毒4型（PCV4）4种类型，病原混合感染情况较普遍^[1]。

PCV2在我国广泛流行，各地区阳性率在43.70%～68.12%，可侵害宿主免疫系统，是猪场最严重的病原之一^[2]。继2000年我国首次报道检测到PCV2阳性抗体，四川地区2004年报道检测出PCV2阳性，之后不断被报道^[3]，PCV2已成为猪圆环病毒感染猪群的主要流行毒株。PCV2主要感染5~12周龄仔猪，感染后会引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍、猪呼吸病综合征、初生仔猪先天性震颤、坏死性间质性肺炎等疾病^[3]，严重危害养猪业的健康可持续发展。四川西昌市养猪业发展势头强劲，掌握PCV2在该地区猪群中的流行情况对保障猪群健康和推动产业发展至关重要。

本研究通过检索分析2012年以来有关西昌市PCV2流行病学监测的公开文献资料，同时对2023年西昌生猪养殖情况和养殖环境中PCV2污染情况等开展补充调查和检测分析，综合研判西昌生猪养殖中PCV2的主要流行情况及定殖情况，以期为PCV2的病原学研究及猪圆环病毒病的综合防控提供基本数据。

1 材料与方法

1.1 文献检索

检索并分析中国知网数据库收录的2012年以来有关“西昌市PCV2流行病学监测”的文献资料。

1.2 样本信息

2023年5月，根据西昌市生猪存栏养殖量100头以上养殖场（户）分布(表1），按照估计流行率的样本量计算，置信水平95%，可接受绝对误差10%，预期流行率40%进行抽样，累计抽样场点位于全市范围内常年存栏100头及以上的生猪养殖户39个，每个场点采集5份环境拭子，混合成1份样品进行检测。根据养殖场的配合程度、养殖区域、养殖存栏量，2023年5—9月共采集42个场、85份混合样品进行检测。

由表1可见，西昌市22个乡镇（街道）中，有15个乡镇（街道）常年存栏100头及以上的有67户，其中，生猪存栏5 000~5 999头的有1户（1.49%），存栏1 500~1 999头的有2户（2.99%），存栏1 000~1 499头的有1户（1.49%），存栏500~999量的有5户（7.46%），存栏400~499头的有3户（4.48%），存栏300~399头的有3户（4.48%），存栏200~299头的有16户（23.88%），存栏100~199头的有36户（53.73%）。其中，育种猪场1户（1.49%），育肥猪场4户（5.97%），育种和育肥猪场62户（92.54%）。

1.2 主要试剂与仪器设备

PCV2型荧光PCR检测试剂（青岛立见生物科技有限公司），自动核酸提取试剂盒（南京中科拜尔医学技术有限公司），全自动核酸提取仪器（奥盛Auto-Pure32A），全自动PCR分析系统（天隆Gentier 96R），Ⅱ级生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司），移液器（德国Eppendorf，带滤芯吸嘴）。

1.3 总DNA提取

检测样品在采集后加入3 mL灭菌生理盐水，浸泡10 min，用旋涡振荡器15 s后，置于-20 ℃冰箱中等待或直接进行下一步试验。蛋白酶K在使用前恢复至室温（18~20 ℃），用旋涡振荡器振荡15 s后用瞬时离心机离心10 s。按照试剂说明书，将200 µL上清液检测样品、20 µL蛋白酶K液加入自动核酸提取试剂盒后上机，将提取到的DNA样品装入0.5 mL无核酸EP管中，置于PCR冰盒上或置于-20 ℃冰箱中，等待下一步试验。

注：“—”表示不计。下同。

1.4 PCR检测方法

所有试剂、检测样品在使用前恢复至室温（18~20 ℃），用微型振荡器振荡15 s后用瞬时离心机离心10 s。按照试剂说明书，进行PCR反应液配置，将20 µL PCR反应液加入每个PCR反应管中，分别取5 µL提取到的DNA样品、阴性对照、阳性对照加入不同的PCR反应管中，瞬时离心10 s，然后置于荧光PCR仪中。反应程序为37 ℃孵育2 min；95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。60 ℃收集FAM荧光标记信号。

1.5 结果判定

结果有效性：阳性对照应出现特异性扩增曲线且Ct值≤35，且阴性对照无特异性扩增曲线或无Ct值，则试验成立，否则试验不成立。当样品的扩增结果有典型的扩增曲线且Ct值≤38时可判定为猪圆环病毒Ⅱ型核酸阳性；当样品Ct值>40或无Ct值时可判定为阴性；当38<样品Ct值≤40时判定为猪圆环病毒Ⅱ型可疑，需重新提取核酸，重复检测仍为可疑，则判定为猪圆环病毒Ⅱ型核酸阳性。

2 结果与分析

2.1 文献检索分析

从中国知网数据库检索到2012年以来有关西昌市PCV2流行病学监测文献共5篇，其中血清学3篇（表2）、病原学2篇（表3）^[4-8]。由表2可见，西昌市2008年首次公开检测到未免疫的PCV2抗体，发现2008—2012年适度规模养殖场未免疫的PCV2抗体在70%左右；散户阳性率比养殖场稍低，在67%左右。表3显示：西昌市2017年首次公开检测到PCV2病原，2017—2019年PCV2病原学阳性率平均为83.69%，2篇文献的研究结果由于样品数量和类别不同，导致阳性率差异很大（50.23百分点）。综合血清学抗体与病原学监测文献分析，认为西昌市2008—2019年PCV2感染情况较严重。

2.2 PVC2检测结果

2023年5—9月，对西昌市部分中小规模生猪养殖场的环境拭子进行了圆环病毒Ⅱ型PCR检测，结果见表4。

1）样本分布。共检测存栏100头及以上的42户，其中存栏5 000~5 999头的有1户（2.38%），存栏1 500~1 999头的有2户（4.76%），存栏1 000~1 499头的有1户（2.38%），存栏500~999量的有5户（11.90%），存栏400~499头的有3户（7.14%），存栏300~399头的有2户（4.76%），存栏200~299头的有12户（28.57%），存栏100~199头的有16户（38.10%）。其中，育种猪场1户（2.38%），育肥猪场4户（9.52%），育种和育肥猪场37户（88.10%）。

对照表1，本次环境检测乡镇（街道）数占比西昌市常年存栏100头及以上的乡镇（街道）80%，占西昌市乡镇（街道）48%；检测场数占西昌市常年存栏400头及以上的为100%，存栏300头及以上的为93.33%，存栏200头及以上的为83.87%，存栏100头及以上的为62.67%。

2）阳性场检出率。常年存栏500头及以上的养殖场检测27次，检测场率为100%,检出阳性场次0，检出阳性场数0；存栏400～499头的养殖场检测率为100%,检出阳性场次25%，检出阳性场数33.33%；存栏300～399头的养殖场检测率为66.67%,检出阳性场次33.33%，检出阳性场数50.00%；存栏200～299头的养殖场检测率为75%,检出阳性场次16.67%，检出阳性场数33.33%；存栏100～199头的养殖场检测率为44.44%,检出阳性场次26.09%，检出阳性场数37.50%。西昌市常年存栏100头及以上的养殖场67个，环境检出阳性场次12个，检出率为17.91%（12/67）。

3）发病月份。综合考虑采样频率与数量、试剂数量、监测时间及覆盖范围，2023年7月份未开展抽样检测。通过对调查数据的统计分析，西昌市在2023年5、6、8、9月的场阳性环境率分别为0、20%、0、19.44%。

4）阳性结果判定。共开展2次PCR检测试验，第1次试验阳性对照Ct值为18.934，阴性对照Ct值为0，试验成立，部分样品Ct值大于38且小于40，判为可疑；第2次试验针对第1次试验的可疑样品重新提取DNA并开展PCR试验，阳性对照Ct值为21.762，阴性对照Ct值为0，试验成立，根据试验判定标准，综合2次PCR检测试验结果得出结论：2023年5―9月的42个场85次环境样品检出阳性场次15.29%，阳性场数28.57%。

3 讨论

本研究中选取的中小规模猪场抽查范围较广，样本具有一定的代表性。2023年5—9月环境检测次数为85次，共检测42个养殖场，其中育种场1个，阳性场0个；育肥场4个，阳性场1个（25.00%）；育种和育肥场37个，阳性场11个（29.73%）。检出阳性场次15.29%，阳性场数占比28.57%。共检测12个乡镇（街道），6个乡镇检测出阳性，阳性率50%。高草检测阳性场率83.33%,太和33.33%，长安33.33%，礼州25.00%，黄联20.00%，裕隆16.67%。

本研究中，2023年7月份未开展抽样检测。通过调查分析，西昌市在2023年5、6、8、9月的场阳性环境率分别为0、20%、0、19.44%。根据查阅的文献资料，2022年齐鲁动保第三方检测机构检测发现PCV2有8个月场阳性率超过40%，以3—8月尤为严重，其中场阳性率5月66.7%、6月47.0%、8月54.5%、9月31.3%^[9]。这与本文的检测结果有一定的相似性。

本试验中未对检测为圆环病毒Ⅱ型阳性的样品进行基因测序，无法判断出养殖环境中的流行基因亚型。根据西昌市PCV2流行病学监测（病原学）情况（表2），初步推断主要流行毒株为PCV2b亚型和PCV2d亚型^[7]。

2023年，西昌市中小规模生猪养殖场圆环病毒Ⅱ型的环境定殖率为17.91%，易传播时间在6月和9月，养殖规模越大的猪场通过氢氧化钠等进行环境消毒能较好控制环境中的圆环病毒Ⅱ型定殖。综合2012年以来有关西昌市PCV2流行病学监测文献和环境拭子的检测结果，西昌市圆环病毒Ⅱ型的定殖情况严重，需有针对性地制定防控策略。

参考文献

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基金资助

2022年度凉山州学术和技术带头人培养项目(凉人社办发〔2023〕5号)