1例家兔大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合感染的诊治

摘要

2023年5月末，贵州省赫章县某兔场养殖家兔突然出现精神沉郁、采食量减少、腹泻及死亡的临床症状。为了确定家兔急性死亡的病因，本研究进行了病例的流行病学调查、临床症状和病理剖检变化观察，以及病变组织样品的细菌分离培养、涂片镜检、PCR鉴定、动物试验，同时对分离菌株进行药敏试验，从而筛选特效治疗药物。结果表明：通过该兔场的病例情况及细菌的分离培养及鉴定，确定该试验分离菌株为具有一定毒力的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，确诊该病例为家兔大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合感染。2种菌株均对头孢哌酮、米诺环素、环丙沙星、多黏菌素B较为敏感，可作为该养殖场的临床治疗参考药物。

关键词

家兔 / 大肠杆菌 / 金黄色葡萄球菌 / 混合感染 / 诊治

家兔大肠杆菌病是一种以水样或胶冻样腹泻为主的肠道传染病，主要由致病性大肠埃希氏菌感染所引起，可严重导致幼兔存活率低下和生长发育受阻。该病一年四季均可发生，生长阶段的家兔均易感，主要发生于断乳至4月龄幼兔，是断乳后幼兔发病率、病死率最高的一种急性传染病^[1]，病兔前期表现消化道症状，以严重腹泻为特征，后期可出现全身症状。兔葡萄球菌病为家兔养殖过程中常见的传染病，感染家兔常引发脓毒血症，并且根据不同感染途径和部位，还可表现足跖面皮炎、鼻炎、乳房炎和肠炎等临床症状^[2]，严重时可导致全身性感染，并迅速死亡。

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是家兔养殖过程中极为常见的病原菌，二者也极易发生混合感染，从而导致临床症状复杂化，增加了临床诊治难度。由于大肠杆菌病和葡萄球菌病的高发病率，养殖场存在经常使用药物治疗的现象，从而导致2种细菌具有不同程度的耐药情况，因此，在治疗2种细菌感染时，筛选敏感药物对指导临床用药具有重要意义。本研究对贵州省赫章县某规模化兔场大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合感染致死家兔进行临床剖检、实验室诊断及药敏试验，旨在为家兔养殖过程中出现2种疾病混合感染的防治提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

贵州省赫章县某家兔养殖场因严重腹泻、极度脱水而亡的家兔，临床剖检可见肺脏、肝脏、肾脏出现不同程度的出血；胃因充满气体和液体而膨大，黏膜点状出血且部分脱落；十二指肠充满气体和混有胆汁的黏液；空肠、回肠、盲肠充满透明胶冻样液体，并混有气泡；肠黏膜充血、出血；胆囊肿大，黏膜水肿；膀胱扩张，内含大量黄色尿液。取其病变肺脏、肝脏、肠、黏膜等作为试验病料。

1.2 主要试剂和仪器

DYY-8C型电泳仪购自北京六一生物；PCR仪购自苏州东胜兴业科学仪器有限公司；凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司；恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.3 细菌的分离鉴定

将剖检病死家兔肝脏、肺脏及肠道等典型病变的组织样品在超净工作台内接种于普通琼脂培养基，37 ℃恒温培养箱中培养24~48 h，然后在超净工作台中将单个菌落接种于麦康凯琼脂培养基上，37 ℃恒温培养箱中培养24 h。若有单个菌落生长，将其挑取并进行革兰氏染色及镜检。

1.4 生化试验

使用生化常规微量鉴定管接种分离的菌株，37 ℃恒温箱中培养24～48 h后观察。

1.5 引物设计与合成

根据NCBI GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库，利用Primer Premier6.0设计扩增16S rRNA通用引物（表1）。

1.6 细菌DNA提取及PCR鉴定

挑取单个菌落接种于LB液体培养基，37 ℃摇床内培养24 h，将菌液10 000 r/min离心10 min，收集菌体，提取细菌基因组DNA，利用引物分别进行扩增，将PCR扩增产物进行测序分析。PCR反应体系和反应程序根据2×Taq Master Mix说明书配制和设置，退火温度为57 ℃。

1.7 动物试验

将上述分离菌株的培养菌液经无菌生理盐水洗涤3次，然后再使用无菌生理盐水将菌液浓度稀释至1.0×10⁸ CFU/mL，选取6周龄健康雌性昆明小鼠18只并随机分为3组，试验组分别腹腔注射菌株1和菌株2，攻菌剂量各为0.2 mL/只，对照组腹腔注射0.2 mL/只的生理盐水，观察实验小鼠的精神状态、临床症状以及生存状态，试验观察期为14 d。

1.8 药敏试验

选择16种常用药物的药敏纸片进行药敏试验，将分离菌株的培养菌液均匀涂抹于普通琼脂平板，将药敏纸片贴于培养基表面，置于37 ℃培养24 h。根据药物抑菌圈直径的大小判定分离的2种细菌菌株的药物敏感性。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养结果

可在普通琼脂培养基上观察到2种不同菌落，菌株1为表面光滑、半透明、中间隆起、湿润、灰白色圆形菌落；菌株2为边缘整齐、湿润、光滑、非透明、小米粒样金黄色圆形菌落。在麦康凯琼脂培养基上仅观察到菌株1，且为粉红色，菌株2在该培养基上不生长。革兰氏染色及镜检可见菌株1为两端钝圆、分散排列的革兰氏阴性短杆菌（图1），菌株2为圆形、多个排列的革兰氏阳性球菌（图2）。

2.2 生化试验结果

由生化试验结果可知，分离菌株1符合大肠杆菌的生化特性，分离菌株2符合金黄色葡萄球菌的生化特性，各生化常规微量鉴定管阴阳性结果见表2。

2.3 PCR扩增鉴定结果

使用16S rRNA通用型引物分别PCR扩增2种分离菌株，均扩增出大小为1 460 bp的单一目的片段，扩增结果与预期片段大小一致（图3），且将测序结果在GenBank进行BLAST比对分析，鉴定为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，同时对其进行进化树分析，发现分离大肠杆菌菌株与大肠杆菌HCD16-7株（登录号为MH111534.1）同源性为98.75%，金黄色葡萄球菌菌株与多株金黄色葡萄球菌同源性高达99%。

2.4 小鼠致病性试验结果

取2种浓度均为1.0×10⁸ CFU/mL的菌株各0.2 mL，注射小鼠12 h后均出现精神不振和不同临床症状，菌株1注射小鼠在48 h后全部死亡，剖检可见其肺脏和肝脏等出现不同程度肿大和出血、胃肠肿胀等现象；菌株2注射小鼠在48 h后有4只死亡，剖检可见皮下出血、内脏器官出现脓肿，剩余2只小鼠精神不振，采食量明显下降，对照组小鼠一切正常。采集每组病死小鼠的肺脏、肝脏等病变组织进行染色镜检，分别与细菌分离培养镜检结果一致，表明分离的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有一定的毒力，所以导致养殖场感染的家兔发病。

2.5 药敏试验结果

选择22种常用药物的药敏纸片，采用纸片扩散法进行药敏试验，测定对分离的大肠杆菌和葡萄球菌药物敏感性，结果表明该场分离的大肠杆菌对头孢哌酮、米诺环素、氧氟沙星、环丙沙星、多黏菌素B较为敏感，对头孢唑林、阿米卡星中度敏感，对其余15种药物具有耐药性；分离的金黄色葡萄球菌对氨苄西林、头孢哌酮、米诺环素、克拉霉素、环丙沙星、多黏菌素B较为敏感，对头孢曲松、头孢噻吩、阿米卡星、四环素、氯霉素中度敏感，对其余11种药物具有耐药性（表3）。2种菌株均对属于β内酰胺类抗生素的头孢哌酮、属于四环素类抗生素的米诺环素、属于喹诺酮类抗生素的环丙沙星、属于多肽类抗生素的多黏菌素B较为敏感。

3 讨论

随着产业结构的调整，家兔商品价值不断突出，家兔养殖业不断向规模化发展，相关疾病问题也日益凸显，大肠杆菌病和金黄色葡萄球菌病为家兔养殖过程中常见的传染病，混合感染后对家兔的危害极大，严重影响养殖经济收入。禽源大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合感染现象报道较多^[3-6]，但较少报道兔源大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合感染病例。本试验从贵州赫章地区某兔场临床病料中分离出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，药敏试验结果显示2种菌株均对头孢哌酮、米诺环素、环丙沙星、多黏菌素B较为敏感，可作为该养殖场临床治疗的参考药物。本研究药敏试验所采取的抗生素包括β内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、林可酰胺类、喹诺酮类、氯霉素类、多肽类，2种菌株对不同类别抗生素、同一类别不同抗生素表现出不同程度的敏感性和耐药性，可能与实际养殖过程中不同抗生素药物的使用频率有关^[7]。该场分离的2种细菌也具有较高程度的多重耐药性，多项研究证明不同动物来源、不同地区的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌耐药性也存在一定差异^[8-9]，本试验推荐的抗生素仅用于为该养殖场临床用药提供指导依据，当养殖家兔发生大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合感染时，养殖场应根据药敏试验结果进行科学合理使用抗生素，临床治疗才具有针对性和有效性。

4 结论

本研究通过对贵州省赫章县某规模化兔场因严重腹泻而死的病兔进行病原菌的分离鉴定、生化鉴定、PCR鉴定及致病性试验，确定该养殖场因混合感染致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌而发病，并可根据药敏试验结果来选择临床治疗药物，可快速有效控制病情的蔓延。

参考文献

[1] 王莉, 郭亚男, 马晓燕, 兔大肠杆菌病的耐药性研究进展[J]. 甘肃畜牧兽医, 2023,53(2):1-3.

[2] 牛群, 孟庆福, 黄敏, 肉兔金黄色葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 福建畜牧兽医, 2023,45(2):17-20.

[3] 张晓梅, 孙培明. 一例雏鸭大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合感染的分离鉴定与耐药性研究[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2020(7):85-90.

[4] 施小生, 刘逸, 邓贤才, 鹅大肠杆菌与葡萄球菌的混合感染[J]. 江西畜牧兽医杂志, 2017(5):30-32.

[5] 张迎春, 卫兰, 仲青花, 鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合感染病原的分离与鉴定[J]. 青海畜牧兽医杂志, 2005(5):13-14.

[6] 于冬玲. 鸡大肠杆菌和葡萄球菌混感的诊治[J]. 畜牧兽医科技信息, 2016(12):100.

[7] 徐靖怡, 刘玉梅, 王佳佳, 家兔大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合感染的诊断及药物敏感性分析[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2023(6):70-75,141-142.

[8] 谢辉, 刘玉梅, 张昕, 兔金黄色葡萄球菌的分离鉴定和耐药性分析[J]. 中国兽医杂志, 2022,58(4):81-85.

[9] 林巧彬. 一起肉兔大肠杆菌病的诊治与体会[J]. 福建畜牧兽医, 2022,44(6):95-96.