科研训练融入水产类专业本科教学的改革与实践——以《水草组织细胞培养》课程为例

Reform and practice of integrating the training in scientific studies into the teaching of undergraduates in the major of aquatic science and technology：Taking the course Tissue and Cell Culture of aquatic plants as an example

摘要

目的 《水草组织细胞培养》是水族科学与技术专业的一门理论与应用相结合的课程，将科研训练融入本门课程教学，以更好地提升教学效果。 方法 首先针对水草组培过程中污染频发这一现象，引入科研问题，并设计应对的实验防治方案与操作流程，进行详细讲解和实验演示，然后安排同学们分组执行实验，并进行后续实验观察与数据分析，最终有效完成组培污染的治理。 结果 提高了学生学习的兴趣，提升了学生动手实践的能力，使课堂教学效果得到了很大的改善。 结论 将科研训练融入课程，既锻炼了同学们的实践能力、理论应用及科研探索能力，又使其能够学以致用，去解决实际生产问题，为以后从事水草扩繁生产和相关科学研究打下基础。

关键词

组织培养 / 污染防治 / 科研训练 / 教学效果

Key words

tissue culture / prevention and control of pollution / training in scientific studies / effect of teaching

当今社会科学技术日新月异，离不开创新创业的发展与举措。创新是社会进步的灵魂，习近平总书记在党的十九大报告中50余次提到“创新”，强调创新是建设现代化经济体系的战略支撑，创业是推进经济社会发展的重要途径。2018年全国两会报告又强调了创新创业教育的重要性，并提出创新创业应重在教育^[1-2]。2024年，习主席在十四届全国人大二次会议上再次强调：“要增强创新自信，从实际出发，大力推进自主创新和原始创新”^[3]。髙校是创新人才培养的主阵地，在“大众创业、万众创新”大背景下，国内诸多高校也纷纷进行了人才培养模式的改革和探索，其中，大学生科研训练被普遍认同和采纳。科研训练是指在掌握一定学科专业知识和技能上，为解决某一科学问题而进行的创造性研究活动。科研训练是提高大学生科研能力、创新能力及综合素质的重要途径之一，是本科创新人才培养的重要组成部分。通过科研训练，可有效加强学生对知识的把握度和对研究的参与度，提升其专业能力和实践能力，使学生获益良多^[4]。但目前的统计数据表明，超过70%的大学生实际科研参与度并不高，这可能与其受到时间、平台和教学资源限制相关^[5]。因此，如何将科研更好地融入课堂，使之丰富、立体、生动和革新，使所学为所用，一直是值得思考和研究的课题，也是本文的主旨所在。本文以水产类专业课程《水草组织细胞培养》为例，探究如何将科研训练融入其课程教学中去，以提高教学效果，提升学生的科学思维和创新能力。

《水草组织细胞培养》是主要讲授水草组培快繁技术的专业课程，包括水草组培步骤流程、离体快繁的方法、脱毒苗的培育、原生质体培养、人工种子和种质保存等主要内容，是一门紧密结合实践的应用性学科。水草，也称为水生植物，常生活在淡水或盐水中，具有不同的生命周期和结构，其多样性丰富^[6]。

根据生长方式可分为挺水植物、浮叶植物、自由漂浮植物、沉水植物和湿地植物^[7] ，具有维持水质、治理环境污染、恢复生态平衡以及药用治疗等多种功能^[8-12]。值得关注的是，水草纤维含量较低，营养价值较高，添加入饲料中，可有效促进鱼、虾、蟹、蛋鸡等的快速生长，是鱼和畜禽的良好饲料来源，天然水草饲料资源化既可有效解决饲料资源匮乏，又可减少环境污染风险^[13-15]。另外，近年来水草造景艺术在国内外流行，也促使水草的需求量日益升高，而运用植物组织培养技术可以快速繁殖水草，极大节省生产成本。目前，植物组织培养的研究多集中在陆生植物^[16]，水草相较于陆地植物，根系欠发达，整体偏弱，在组培过程中难度更高。而且培养基更容易出现污染菌，如小水榕（Anubias barteri）^[17]、雪花草（Hottonia inflata）^[18]、小对叶（Rotala rotundifolia）^[19]等均已见相关报道。但是关于水草组培过程中污染菌的种类及防治目前尚不清楚。

水草组培污染防治实验作为水草组培顺利进行的重要保障手段，目前国内课程多数局限于污染预防实验的讲解，为了使学生更好地理解水草组培污染防治的原理，以污染防治实验为出发点开展组培污染防治教学是非常必要的。

基于此，本课程教学过程中提出这一紧密联系生产实际的科研问题，以水草红丝青叶组培过程频发污染菌现象为例，设计实验解决方案，带领水产类专业学生完成相关探索性研究，丰富水草组织细胞培养的课程教学内容，锻炼学生的动手能力，提高其自主能动性，为今后学习、工作和创业打下坚实的基础。

1 科研训练融入《水草组织细胞培养》课程的教学分析

通过水草组培污染防治实验训练学生对水草组培污染源种类及其治理规律的认识，以解决水草组培过程中严重污染问题为目标，进行教学设计安排。如图1所示，在理论授课过程中提出科研问题引发同学们思考，并就相关问题做出具体回答，充分引导学生探索实验方法、原理以及数据处理等知识。以水草组培污染与防治为核心问题，对学生进行教学实验指导，带领学生进行污染源分离、鉴定及药物筛选，首先运用理论课堂上学习的水草组培培养基制备、污染菌分离、鉴定知识，让学生熟练掌握水草组培污染菌分离方法及鉴定原则，并开展污染菌药敏检测及数据分析等实验，让学生掌握水草组培污染菌抑制药物的筛选及防治研究的操作步骤，并启发他们如何进行探究，加强对水草组培课程理论基础知识的理解与应用。同时进行实验演示，直观展示各种菌的分离及表型鉴定分析的过程，使学生更加了解污染源的种类与治理原则，加强对防治机理的理解，培养学生的综合能力和科研探索精神。

同时，在实验过程中开展教学工作，详细介绍研究组培污染源的分离、鉴定的技术操作原理及其在组培培养基优化中的应用原则，讲解药物防治的实验原理和药物筛选相关的注意事项。

学生分组后安排执行实验，并进行后续实验结果观察与生物学统计分析，撰写完成实验报告（图1）。

结合理论知识与实验内容，从方案的制定到实验条件的摸索尝试，从实验规程的讲解到实践的操作，从理论知识的复习到实验数据的处理，让学生参与实验的全过程，从而实现理论联系实际、理论指导实验的目标。

2 科研训练的实验内容及流程

针对水草组培过程中严重污染问题，提出解决方案。介绍水草组培污染菌分离、鉴定及药物筛选实验设备组成、试验操作过程及注意事项。重点讲解实验原理，包括以下方面：①抗生素可以通过以下几种途径抑制或杀灭细菌：影响细胞壁的合成；改变细菌细胞膜的通透性；影响细菌细胞的蛋白质合成；抑制细菌核酸合成。②防腐剂可通过以下几种途径抑制或杀灭真菌：抑制霉菌的生长繁殖，通过抑制微生物体内的脱氢酶系统，达到抑制微生物的生长和起防腐作用，对霉菌、酵母菌和许多好气菌都有抑制作用。如图1所示，实验内容与操作流程如下：

2.1 实验材料、仪器与设备

红丝青叶组培苗；MS培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、LB培养基和TSB琼脂平板、75%乙醇、2%次氯酸钠溶液、蔗糖、6-KT、IBA、乳酚棉蓝溶液；FastPure^®细菌 DNA提取试剂盒（Vazyme，南京，中国）、真菌DNA分离试剂盒提取基因组（solarbio，北京，中国）、磷酸盐缓冲液（pH=7.4）；卡那霉素（kanamycin, Kan）、氨苄西林(ampicillin, Amp）、红霉素（erythromycin, Ery）、壮观霉素（spectinomycin, Spc）或氯霉素（chloramphenicol, Chl）、山梨酸钾（potassium sorbate, PS）、苯甲酸钠（sodium benzoate, SB）或双乙酸钠（sodium diacetate, SD）溶液以及纳米银（nanoscale silver, nano-Ag）。

光照培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、显微镜、pH计、剪刀、镊子、酒精灯、玻璃载玻片、玻璃纸胶带、胶头滴管、PCR仪器、琼脂糖凝胶电泳分析仪。

2.2 实验流程与操作步骤

将学生分组，每组学生挑选细菌或真菌试样分离鉴定，并进行抑菌实验操作，培养学生自主能力。

1）植物材料培养。红丝青叶购自中国山东省当地水生植物农场，长5～6 cm、含5～6节的红丝青叶，先用自来水冲洗叶片5 min。在干净的工作台上，把枝段切成4～5 cm段，包含2～3节点，然后用75%乙醇消毒表面30 s，并迅速转移到2%次氯酸钠溶液中10 min，然后用消毒蒸馏水连续搅拌冲洗3次。随后，将消毒后的小枝切成0.5～1.0 cm的外植体，在含有MS培养基的240 mL培养容器（6 cm×9 cm）中培养数周，添加3%蔗糖，1.0 mg/L 6-KT和1.0 mg/L IBA，用0.65%琼脂固化，在高压灭菌(118 kPa大气压，121 ℃，20 min前pH调至（5.8±0.1）。每个培养容器包含2～4个茎的外植体。所有培养物在（26±1） ℃和60%～70%湿度下生长，在16 h光周期(5 000 lx)下使用气候室内的白色荧光灯（宁波，中国）。

2）细菌的分离与鉴定。根据表型观察，细菌污染物通常在1个月内生长在MS培养基中。为了尽可能培养出细菌，将细菌在常见的LB和TSB琼脂平板上划线接种，分别在26 ℃下孵育48 h。然后，选择单个菌落，重新划线。当所有菌落在琼脂平板上的形态相同，并获得细菌分离物的纯培养时，所有分离物分别保存在-80 ℃的加入15%甘油的LB或TSB肉汤中。

用无菌磷酸盐缓冲液(pH=7.4)洗涤细菌细胞2次，根据制造商的方案使用FastPure^®细菌 DNA提取试剂盒(vazyme，南京，中国)提取基因组DNA，作为 PCR反应的模板。PCR反应中加入10.0 μl 2 x Taq PCR Mastermix，10 μmol/L正义引物(27F)和反义引物(1492R)各0.4 μL，500 ng模板DNA 1.0 μL，无菌蒸馏水最终体积达20 μL。采用通用引物27F(正义引物，5'-AGAGTTGATCATGGCTCA-3')和1492R(反义引物，5'-GGTTCACTTGTTACGTT-3')对所有分离株进行PCR扩增16S rDNA基因，如前所述^[7]。扩增在热循环器(BioRad, USA)中进行，循环前在95 ℃变性5 min，然后在94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s和72℃ 1 min连续循环34次，最后在72 ℃延长7 min。PCR产物在1% 三乙酸-EDTA缓冲液中用1.2% 琼脂糖凝胶(含GelRed)电泳分析。在紫外线照射下观察凝胶并拍照。PCR产物送至生物测序技术有限公司，进行Sanger测序。然后，将16S rDNA序列提交至NCBI GenBank数据库，使用BLASTn算法进行blast，根据鉴定为同一种细菌的16S rDNA序列的核苷酸同源性需在97%以上的原则，进行细菌种类分析判断。

3）真菌的分离与鉴定。MS培养基中也出现了数种真菌，依据表型观察，选择典型真菌并接种于马铃薯葡萄糖琼脂板上，用 26 ℃培养72 h，多次接种后得到真菌培养物，在4 ℃的环境下保存于PDA 板上备用。用乳酚棉蓝溶液染色真菌蓝，用透明纸胶法检测真菌形状^[6]。将一根含有真菌样本的玻璃纸胶带压在玻璃载玻片表面，另一根玻璃纸胶带粘贴在玻璃载玻片的非磨砂端。然后在胶带的交叉处滴上1滴乳酚棉蓝溶液。几分钟后，乳酚棉蓝溶液渗透到真菌体中，显微镜下观察真菌形态并拍照。

采集菌丝并用无菌玻璃球研磨，用真菌DNA分离试剂盒提取基因组DNA。以DNA为模板进行PCR反应，使用ITS-F（上游引物，5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS-R(下游引物，5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')扩增真菌核糖体基因的内部转录间隔物(ITS)序列^[10]，随后采用上文“2.2 2）”所述的类似程序。

4）系统发育树的构建。利用Mega 6.0中CLUSTALX程序生成的多序列比对，采用邻接法(neighbor-joining method)构建系统发育树^[8]。遗传距离矩阵采用Kimura的双参数模型（Kimura’s two-parameter model）^[9]得到1 000个重复的 Bootstrap值以百分比显示。

5）抑菌的药物筛选试验。细菌在26 ℃ LB肉汤中培养24 h。在LB肉汤和琼脂平板中分别添加终浓度50 μg/mL卡那霉素(Kan)、100 μg/mL氨苄西林(Amp)、250 μg/mL红霉素(Ery)、200 μg/mL壮观霉素(Spc)或25 μg/mL氯霉素(Chl)，接种OD=0.5的细菌并均匀涂布，26 ℃培养观察细菌生长情况。检查抗生素耐受水平，并相应地记录为敏感(-)或耐药(+)。

分别添加0.015 625%、0.031 25%、0.062 5%、0.1%、0.125%、0.25%、0.5%和1%山梨酸钾(PS)于PDA琼脂板上，在26 ℃条件下，生长2周观察真菌。同样，测试一系列浓度的苯甲酸钠(SB)或双乙酸钠(SD)溶液以及纳米银(nano-Ag)对真菌的抑制作用。

6）抗菌剂对外植体的影响试验。测试了抗菌药物对外植体的影响。将外植体或幼苗接种相关药物添加的培养基。一方面，MS培养基加入50 µg/mL Kan和25 µg/mL Chl（Kan + Chl）、1/2（Kan + Chl）、1/5（Kan + Chl）和1/10（Kan + Chl），记录抑菌效果，观察外植体生长情况2周。另一方面，MS培养基加入PS、SB和SD（0.015 625%、25%、0.062 5%、0.061%、0.2%和0.5%）对真菌的抑制和对外植体生长的影响。最终确定适宜的抗菌药物组合及浓度。

7）移栽。将幼苗移植到水族箱水草泥或土壤中，记录其2个月的生长情况并拍照。

在研究过程中，不定期检验每组实验情况并适时抛出问题引起同学思考，调动学习积极性，寻找解决方案并验证。课程结束后，继续进行后续实验及数据分析，并形成实验报告。

3 科研训练提升教学效果和学生能力

采取《水草组织细胞培养》课程与水草组培污染防治实验相结合的教学模式，课堂的教学效果和学生能力均得到极大的改善和提升。学生能够接触水草，亲自参与动手操作，不再停留于专业术语的概念记忆，而是将其深度解读，走进科学研究，直面实际存在的问题，带着问题去学习，既提高了学习的兴趣和积极性，又极大提升了学习的自主性和参与度。同时，对水族科学与技术专业类学生进行培养，通过组培教学平台可以有效提升学生的综合实践能力。

1）科研思维与态度。培养基配制与优化是水族科学与技术专业类学生参与水草组培的必备基础，引导学生更好地理解组培成功的操作原理与过程。让学生了解水草组培污染防治对水草组培成功的关键作用与重要意义，拓展水草组培培养基优化的配方分析，引导学生思考如何防治培养基污染实验的基本原理。培养学生理论研究水草组培污染防治试验整体思维，培养科研头脑，提高科研能力。

2）合作能力与团队精神。水草组培污染防治实验需要有步骤地有序进行，不是一蹴而就的，需要团队协作，本科学生人数较多，课程采用学生分组方式进行实验。将学生分成５或６组，分阶段接替完成，这样确保每个学生都能够动手实践的同时培养学生互相协作能力，提高学生自主学习性。

3）理论应用能力。通过水草组培污染防治实验为学生详细讲解组培理论、检菌原理、防治机理和培养基优化分析等知识，结合实验测试原理，对收集的数据进行分析。直观地了解组培、污染源检测、抑菌机制等概念，加强学生对理论知识的理解。使学生在实验课程中牢记理论知识，并能在实验中灵活运用，以达到理论与实践相结合的目的。

4）实践动手能力。在传统教学中偏重于理论，对着书本进行教学，学生也对着书本学习，不利于对水草组培污染防治实验形成一个全面立体的概念，新教学模式结合水草组培污染防治实验，学生可以实际参与实验流程：方案设计→组培培养基制备→污染菌鉴定实验→药物筛选防治实验→数据分析，让学生在进行实验过程中由动手带动动脑，动脑指导动手，提高实践操作能力的同时更加深刻地了解水草组培培养基优化知识。

4 结语

本文聚焦《水草组织细胞培养》课程中水草组培污染频发问题，开展科研训练研究，通过教学实验设计，将科研训练适时逐渐渗透融入贯穿到教学过程中去，带领学生学习组培培养基配制、污染菌分离与鉴定、真菌分离与鉴定、药敏反应等知识和技能，并通过药物测试实验，最终确定适当的抑菌药物组合及浓度，有效预防和抑制了水草组培中微生物的感染，维护了水草组培培养的正常顺利进行。

科研训练融入本门课程教学，积极调动了学生学习主动性，促进和增强其实验参与性，使学生理论和实践应用的整体科研思维和实践能力等得到提升，为水产类（水族类）专业学科的课程改革提供了新视角和新思路。

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基金资助

国家自然科学基金青年基金项目(31902408)

山东省自然科学基金面上项目(ZR2023MC154)

青岛农业大学实验技术研究课题(SYJS202326)

青岛农业大学课程思政教育专项(XJY2022141)

青岛农业大学博士基金项目(1120035)