猪粪中氧氟沙星酶联免疫吸附分析法的构建及应用

Establishment and application of ELISA for ofloxacin in pig manure

摘要

目的 为粪便中其他小分子抗菌药物的酶联免疫分析方法的构建提供技术借鉴，实现猪粪中氧氟沙星禁用抗菌药物的养殖全过程管理。 方法 采用碳二亚胺法，将氧氟沙星（OFL）与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联，制备出人工抗原OFL-BSA和OFL-OVA。使用OFL-OVA抗原制备氧氟沙星单克隆抗体，使用OFL-BSA作为包被抗原建立氧氟沙星间接竞争酶联免疫吸附（ELISA）方法。风干的猪粪样品经醋酸-醋酸钠溶液（pH约4.0）与甲醇的混合液（1∶3，V/V）提取及稀释后测定。 结果 建立的氧氟沙星间接竞争ELISA方法在标准溶液浓度范围（0~81 ng/mL）内线性良好（r>0.99），方法检测限为3.5 µg/kg。不同添加浓度的氧氟沙星回收率为70.8%~86.8%，变异系数为0.7%~4.7%。应用该法检测79份猪粪实际样品，检测结果与液相色谱-串联质谱法的分析结果具有良好的一致性。 结论 该方法准确、灵敏、快捷，可用于猪粪中氧氟沙星残留的快速分析。

关键词

氧氟沙星 / 酶联免疫吸附法 / 猪粪 / 快速检测 / 兽药残留

Key words

ofloxacin (OFL) / enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / pig manure / quick test / residues of veterinary drugs

氧氟沙星（ofloxacin，OFL）是农业农村部第2292号公告中明确规定禁止使用于养殖过程的４种药物之一。国内外关于以氧氟沙星在内的喹诺酮类药物在动物体内的药代动力学研究都已报道，通过试验表明氧氟沙星经动物体内代谢后仍能以原型检测，可以作为其标志物^[1-2]。2020年农业农村部第194号公告出台后，商品饲料全面“停抗”。有效识别排泄物中是否存在抗菌药物残留可以从养殖产业链粪污端追溯整个养殖环节是否合理用药，实现养殖全过程管理。但目前国内外尚无针对粪便基质的喹诺酮类抗菌药物的定性定量方法或标准，现有方法或标准主要聚焦在养殖产业链的前、后端，包括饲料、动物性产品等^[3-5]。因此，畜禽养殖过程粪便中以氧氟沙星为代表的抗菌药物的暴露情况因标准技术的缺失，一直缺乏全面充分的基础数据，其中各药物残留限量值更是存在较大的缺口。

目前，氧氟沙星的主要检测方法有液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）^[6]、高效液相色谱法（HPLC）^[7]、微生物法^[8]等。HPLC-MS/MS法是检测OFL残留较理想的方法，具有较高的灵敏度和选择性。但由于仪器价格昂贵，分析的费用高，难以满足最基层实验室日常检测分析的要求。酶联免疫吸附测定法（ELISA）中抗体-抗原免疫分析技术因具有灵敏度高、检测成本低、产品可商业化及可实现现场即时检测等优点^[9]，为目前普遍应用于兽药残留分析的方法之一。因此，本方法利用氧氟沙星抗体与抗原，构建氧氟沙星的间接竞争酶联免疫吸附法，并应用于实际样品中氧氟沙星残留量的快速检测，以期为粪便中其他小分子目标物酶联免疫吸附测定法的开发提供技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

酶标仪（型号为ELX808，美国Bio Tec公司）。

氧氟沙星（纯度为99.3%，Bepure公司）；甲醇（色谱纯，美国Merck公司）；醋酸、无水醋酸钠、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）。

1.2 溶液配制

氧氟沙星储备溶液：称取氧氟沙星标准品10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配成质量浓度为1 mg/mL的标准储备溶液。

醋酸-醋酸钠溶液（pH约4.0）：12.3 g无水醋酸钠与3.45 mL冰醋酸混合，去离子水稀释至1 L，混匀。

醋酸-醋酸钠溶液与甲醇的混合提取液：将醋酸-醋酸钠溶液用甲醇以1∶3体积比稀释，混匀。

20 mmol/L PBS溶液：称取5.8 g十二水合磷酸氢二钠、0.59 g二水合磷酸二氢钠以及9 g氯化钠，加水溶解稀释至1 L。

1.3 氧氟沙星ELISA试剂盒的制备

1）氧氟沙星人工抗原的合成。采用改进的碳二亚胺（EDC）法，以EDC和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为偶联剂，利用氧氟沙星分子结构中的3位羧基，与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）的游离氨基发生缩合反应来制备人工抗原，合成路线见图1。

2）抗体的制备。将OFL-OVA免疫抗原按50 μg/（mL·只）的剂量与等体积弗氏佐剂充分乳化后，腹部皮下多点注射免疫4只6~8周龄雄性BALB/C小鼠，免疫7~10 d，尾静脉采血，间接ELISA检测血清效价。将免疫效果较好的小鼠脾脏与骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG介导融合，间接ELISA筛选阳性克隆；阳性克隆经有限稀释亚克隆后获得遗传稳定的单克隆细胞株，细胞株扩大培养后，接种经降植烷致敏BALB/C小鼠腹腔诱导生产单克隆抗体的腹水。腹水经硫胺纯化，再采用辛酸-硫胺法纯化，得到相应单克隆抗体。

3）酶标氧氟沙星抗体的制备。使用辣根过氧化物酶（HRP）标记氧氟沙星抗体，采用过碘酸钠法（改良法）：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，可与蛋白质上的氨基形成chiff氏碱而结合，即HRP标记到蛋白上。

4）ELISA方法的建立。包被：将OFL-BSA偶联抗原用pH 9.6、0.05 mol/L碳酸盐缓冲液适当稀释后包被96孔酶标反应板，每孔加入100 µL，4 ℃孵育过夜，将孔中液体倾去，每孔加入封闭液250 µL，于37 ℃恒温箱中孵育2 h，将孔中封闭液倾去，于室温25 ℃下烘干2~3 h。

检测：在每孔中加入50 µL系列浓度的氧氟沙星标准品溶液（或样品溶液）和50 µL稀释后的酶标氧氟沙星抗体，25 ℃反应30 min；洗涤4~5次后加入50 µL底物液A（过氧化脲）和50 µL底物液B（四氨基联苯胺），25 ℃显色反应15 min；2 mol/L硫酸溶液终止反应后，设定酶标仪于波长450 nm处测定吸光度值。

1.4 样品前处理

称取1 g自然风干的粪便于15 mL离心管中，加入4 mL醋酸-醋酸钠溶液与甲醇的混合提取液，充分振荡混匀后离心3 min。取1 mL上层液体于65 ℃下吹干。取500 µL PBS（20 mmol/L）溶液复溶，充分溶解后，4 000 r/min离心2 min。取上清液100 µL与100 µL PBS溶液混匀后，取50 µL用于检测，采用酶联免疫吸附法测定。

1.5 标准曲线

分别选择氧氟沙星标准品质量浓度0、1、3、9、27和81 ng/mL，以质量浓度为0 ng/mL时的吸光度OD值为B₀值，相应氧氟沙星浓度的吸光度OD值为B值，以B/B₀的百分比值为纵坐标，以氧氟沙星标准品质量浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图。

1.6 灵敏度

用半数抑制浓度（IC₅₀）和检测限来评价方法的灵敏度。测定20次标准曲线的IC₅₀，统计其平均值和浮动范围；测定20个空白样本，求出其B/B₀在标准曲线上对应的质量浓度的平均值（X）和标准差（S），方法检测限=X+3S。

1.7 准确度和精密度

在空白样本中分别添加3.5、30.0、80.0、150.0 μg/kg氧氟沙星，每个处理做3个平行样本，计算平均添加回收率Rec及变异系数CV。其中，空白样本氧氟沙星实际测量值为1.39 μg/kg。

\mathrm{R} \mathrm{e} \mathrm{c} = \frac{(\mathrm{各添}\mathrm{加浓}\mathrm{度平}\mathrm{均测}\mathrm{量值}-\mathrm{空白}\mathrm{样品}\mathrm{测量}\mathrm{值})}{\mathrm{对应}\mathrm{的添}\mathrm{加浓}\mathrm{度}} \times \mathrm{100} \mathrm{\%} \mathrm{C} \mathrm{V} = \frac{\sqrt[]{\frac{\sum {(\mathrm{各添}\mathrm{加浓}\mathrm{度每}\mathrm{个平}\mathrm{行的}\mathrm{测量}\mathrm{值}-\mathrm{各添}\mathrm{加浓}\mathrm{度平}\mathrm{均测}\mathrm{量值})}^{\mathrm{2}}}{\mathrm{平行}\mathrm{数量}-\mathrm{1}}}}{\mathrm{对应}\mathrm{的添}\mathrm{加回}\mathrm{收率}\mathrm{平均}\mathrm{值}} \times \mathrm{100} \mathrm{\%}

1.8 样品

抽取79份猪粪样品，样品来源于上海各区养殖场。采用本方法进行测定，并将结果与液相色谱-串联质谱法结果比对。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

氧氟沙星的线性相关系数r达0.997 9，表明在1~81 ng/mL范围内氧氟沙星的线性关系良好。

2.2 IC₅₀和检测限

依据要求计算出IC₅₀为9.143 ng/mL，表明制得的试剂盒本身灵敏度良好；测定20个空白样本得出的对应质量浓度平均值为1.101 μg/kg，标准差为0.807。因此，本方法检测限为3.5 μg/kg。

2.3 准确度和精密度

由表1可知，猪粪样品中氧氟沙星各浓度的回收率为73.0%~84.2%，变异系数为0.7%~4.4%，满足方法精密度等要求，具有较好的准确度和灵敏度。

2.4 实际样品检测结果

采用本方法测得79份猪粪样品中氧氟沙星均未检出。依据团体标准《猪粪中氧氟沙星残留量的测定 酶联免疫吸附法与液相色谱-串联质谱法》（T-SHAAV 013—2023）建立了液相色谱-串联质谱法测定猪粪中氧氟沙星，并将实际样品同样采用上述液相色谱-串联质谱法检测发现，样品中氧氟沙星也均未检出。2种方法结果一致，证明本方法具有良好的准确度。

3 讨论

氧氟沙星是养殖过程中的禁用药，这类药物的传统检测样本集中在动物组织中^[10]，采样会对动物体造成损害。而畜禽粪便作为养殖过程中动物的排泄物，可以在不损害动物体的前提下实时反映用药情况^[11]。因此本方法选取粪便作为检测样本具备可行性。氧氟沙星的检测方法多以液相色谱-串联质谱法定性定量，但更多的基层实验室并不具备该仪器或专业操作人员。酶联免疫分析技术操作简单、灵敏度较高、技术成本较低且能够实现大批量样品快速检测^[12]，因此本试验采用的氧氟沙星酶联免疫方法可以在基层实验室内大规模普及。此外，由于动物养殖特点、养殖场环境差异、养殖设施差异等因素，粪便中含水量差异通常比较明显^[13]，本研究粪便检测的处理方式采用干燥粉碎过筛，氧氟沙星并未损失，且统一干燥后测定药物含量会更加准确，有效解决了畜禽粪污因含水量等因素引起的定量不准的问题。综上所述，本方法的前处理过程操作方便、简单快捷、结果准确、灵敏度较高，因此具有较强的可行性，适用于猪粪中氧氟沙星的定量测定，可真实反映养殖过程用药情况。

4 结论

本研究以养殖过程禁用药物氧氟沙星为研究对象，以实验室自制的单克隆抗体为基础，初步建立了猪粪便中氧氟沙星残留检测的酶联免疫法。该方法具有良好的准确度和重复性，能够投入实际生产。氧氟沙星酶联免疫法的建立为进一步开发免疫检测试剂奠定了基础，并为猪粪中氧氟沙星残留的监控提供了便捷、灵敏的检测方法，有利于养殖全过程管理；同时，也能对养殖过程中产生的环境污染物进行监测，减少抗菌药物的排放，促进畜禽养殖科学健康发展。

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基金资助

上海市农业科技创新项目(2023-02-08-00-12-F04584)