乌鲁木齐及周边地区奶牛乳房炎无乳链球菌的分离鉴定及耐药性分析

Isolation, identification and drug resistance of Streptococcus agalactiae from dairy cattle with mastitis in Urumqi and its surrounding areas

摘要

目的 了解乌鲁木齐及周边地区奶牛场奶牛乳房炎无乳链球菌的流行以及耐药性情况，为本地奶牛场无乳链球菌性乳房炎的科学防治提供参考。 方法 采集新疆乌鲁木齐市、生产建设兵团第十二师及周边地区5家规模化奶牛场的300份奶牛乳房炎奶样，进行无乳链球菌的分离、培养，利用荧光PCR方法鉴定，同时对分离出的阳性菌株采用纸片扩散法进行耐药性分析。 结果 无乳链球菌的分离率为8.3%，其对链霉素、青霉素、庆大霉素、氨苄西林耐药率均超过50%，对万古霉素、头孢噻肟、诺氟沙星敏感性≥60%；此外，7株无乳链球菌分离株具有多重耐药性。 结论 建议奶牛场加强日常饲养管理及科学使用抗生素类药物，可优先选择糖肽类、头孢类和喹诺酮类药物进行防治。

关键词

乌鲁木齐 / 奶牛乳房炎 / 无乳链球菌 / 分离鉴定 / 耐药

Key words

Urumqi / dairy cattle with mastitis / Streptococcus agalactiae / isolation and identification / drug resistance

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是导致奶牛乳房炎的主要病原菌之一^[1]，感染后常引起奶牛隐性乳房炎，即亚临床型乳房炎伴有中轻度或间歇性临床型乳房炎发作^[2-3]，属于典型强感染性和传染性的人畜共患致病菌，可通过接触病牛或其奶制品等途径感染人类^[4]。无乳链球菌性乳房炎造成的危害不可忽视。为掌握乌鲁木齐及周边奶牛无乳链球菌性乳房炎的流行情况，本研究采集了新疆乌鲁木齐市、新疆生产建设兵团第十二师及周边地区5家规模化奶牛牧场的300份患有乳房炎的奶样品，并对样品进行无乳链球菌分离、鉴定及耐药分析，为本地区奶牛场无乳链球菌性乳房炎的精准防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1）样品来源。从乌鲁木齐市周边地区的5个奶牛养殖场采集300份患有临床型和隐性奶牛乳房炎的奶样品。

2）主要试剂及仪器。改良胰蛋白胨大豆肉汤（mTSB），哥伦比亚CNA血琼脂平板，哥伦比亚血琼脂平板，厌氧产气袋，革兰氏染液，无乳链球菌荧光PCR检测试剂，革兰氏染液，荧光PCR（7500）仪，生物安全柜（HFsafe-1200LC），高压蒸汽灭菌锅（HVE-50），显微镜（EVOS XL Core），恒温摇床（TH2-92B），恒温培养箱（BPC-250F），电子天平（FA2104N）。

1.2 方法

1）样品采集。奶牛养殖场每月采用兰州隐性乳房炎检测法（LMT）开展隐性乳房炎检测，选择已经筛选的患有隐性乳房炎的奶牛和具有临床乳房炎症状的奶牛。首先用温水清洗奶牛的乳房和乳头，然后采用聚维酮碘消毒，每个乳头擦净消毒液后弃去前3把奶，将奶样挤入50 mL离心管中，拧紧盖子，做好标记，放入有冰袋的保存箱，最后运输至实验室开展试验。

2）细菌分离培养。操作流程如下：

①增菌。在生物安全柜中用移液器吸取5 mL奶样，注入50 mL无菌离心管，加入40 mL改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基（mTSB），放入37 ℃培养箱，培养18~24 h。

②分离。用接种环蘸取1环mTSB菌液，在哥伦比亚CNA血琼脂平板上划线接种，放入盛有厌氧产气袋的封闭罐中，在37 ℃培养箱中培养18~24 h后，观察哥伦比亚CNA血琼脂平板上的菌落形态。

③纯化。挑取可疑菌落，接种哥伦比亚血琼脂平板，在37 ℃培养箱中培养18~24 h。

3）镜检。首先用无菌接种环蘸取适量生理盐水于载玻片上，挑取哥伦比亚血琼脂平板上的单个菌落至载玻片上，涂抹均匀，在酒精灯火焰上固定，然后按照革兰氏染色液试剂盒说明书进行染色，最后将载玻片放入显微镜下镜检（100×油镜）。

4）荧光PCR鉴定。操作流程如下：

①DNA模板的制备。从符合无乳链球菌镜检特征的哥伦比亚血琼脂平板中用接种环蘸挑取疑似单菌落于5 mL mTSB的离心管中，随后在37 ℃恒温摇床中培养18~24 h，按照全自动核酸提取仪和核酸提取试剂盒说明书进行细菌DNA的提取，-20 ℃保存备用。

②反应组分配制。取2 μL样品DNA和23 μL反应液（核酸扩增反应液、HS-Taq酶）加至反应管，反应总体积为25 μL，并且设置阴性对照和阳性对照。

③PCR扩增。设置荧光PCR仪的反应程序，预变性95 ℃ 3 min、变性95 ℃ 5 s、退火/延伸60 ℃ 40 s，40个循环。

5）药敏试验。根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的药敏纸片扩散法(K-B法)，采用无菌生理盐水将无乳链球菌浓度调节至1.510 CFU/mL，用经过高压灭菌的棉签将待测菌悬液涂抹在水解酪蛋白琼脂（MHA）平板培养基表面，均匀涂抹后贴上药敏纸，然后用有齿镊小心按压，使其与培养基水平面无缝接触。37 ℃恒温培养箱孵育16~20 h后，取出平板，用游标卡尺测量抑菌圈直径，并详细记录，评判结果参照CLSI。

2 结果与分析

2.1 培养分离

无乳链球菌在哥伦比亚CNA血琼脂平板上的典型菌落形态：直径2～3 mm，灰白色、半透明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐，并产生β型溶血或非β溶血（图1）。

2.2 革兰氏染色镜检

挑取可疑菌落染色镜检，无乳链球菌为革兰氏染色阳性，球形或卵圆形，排列成短链状（图2）。

2.3 荧光PCR鉴定

本试验结果是根据无乳链球菌荧光PCR检测试剂盒说明书进行判定，结果显示，一共检测样品300份，其中25份阳性，275份阴性，阳性率8.3%，阴阳性对照成立。

2.4 药敏结果

对25株无乳链球菌分离菌株进行药敏试验，选取10种较为常见的抗菌药物进行比对。结果显示（表1），分离的25株无乳链球菌对不同抗生素有不同程度的耐药和敏感。分离的无乳链球菌对青霉素的耐药率最高，为72%，其次为氨苄西林和四环素，耐药率分别为52%和48%；对万古霉素100%敏感，对头孢噻肟和诺氟沙星的敏感率分别为88%和60%。

3 讨论

无乳链球菌属于革兰氏阳性B群链球菌(Group B Streptococcus, GBS)，是引起奶牛乳房炎的优势致病菌之一，在乳房炎奶样中检出率较高^[5]。无乳链球菌是一种具有高度传染性的人畜共患致病菌，在牛群中传播速度较快，而且可以通过食物链传染给人类，使人发生脑膜炎等神经系统疾病^[6]。该菌分布广泛，可长期寄生于奶牛乳腺中，也可在牛场环境及挤奶设备、工具中短时间存活。本研究对乌鲁木齐及周边地区的5家奶牛养殖场无乳链球菌性乳房炎感染情况进行调查研究。结果表明，无乳链球菌的分离率为8.3%，与闫新雨^[7]在内蒙古呼和浩特周边牧场对奶牛临床乳房炎奶样无乳链球菌的分离率12%，尹金花等^[8]在新疆阿拉尔市某牛场隐性乳房炎奶牛无乳链球菌的分离率19.35%相比分离率较低，说明不同地区不同养殖场的无乳链球菌分离率存在差异，这可能与奶牛自身的抗病力、养殖场的饲养管理水平等因素有关。因此，在日常生产管理中应加强科学饲喂、挤奶卫生以及环境消毒等预防措施。

由于无乳链球菌引发的奶牛乳房炎多呈隐性型，临床症状不显著，较易导致误诊或漏诊。加之传统的病原菌鉴定过程步骤繁琐、耗时长，难以满足快速、准确诊断和治疗的需要。本研究中的检测方法结合了传统形态学鉴定方法和现代荧光PCR技术，可为无乳链球菌性奶牛乳房炎的早期快速诊断提供参考。

由于国内尚没有商品化的无乳链球菌性乳房炎疫苗，目前在兽医临床上治疗该病仍以使用抗生素为主要手段，而大量使用抗生素使无乳链球菌耐药性不断增强，甚至还出现了多重耐药。本研究结果表明，分离出的25株无乳链球菌菌株对氨基糖苷类药物的链霉素和庆大霉素、β-内酰胺类药物的青霉素和氨苄西林有较强耐药性（52%~88%）。陈杰^[6]在新疆16个规模化奶牛场牛源无乳链球菌对常见抗生素的药敏试验结果显示，对青霉素、链霉素、氨苄西林、庆大霉素的耐药率分别为89.67%、85.61%、83.76%、43.54%。尹金花等^[8]在新疆阿拉尔市某牛场的牛源无乳链球菌感染情况调查结果显示，对青霉素耐药率为58.3%，四环素的耐药率达50%。以上研究均提示乌鲁木齐及周边地区奶牛养殖场在治疗乳房炎等感染性疾病时频繁应用青霉素、四环素等抗生素的现象较为普遍。本研究分离出的25株菌株中有7株为多重耐药菌株，即对3类或3类以上抗菌药物同时呈现耐药性，表明乌鲁木齐及周边区域奶牛养殖场在使用上述抗生素进行相关疾病的防治中可能存在不规范用药的情况，应采取相关措施严防上述抗生素的过度使用。

本研究分离株对万古霉素、头孢噻肟、诺氟沙星高敏感度（60%~100%），表明在无乳链球菌性乳房炎的治疗中，应科学使用抗生素类药物，可优先选择糖肽类药物和头孢类、喹诺酮类药物等多种药物交替使用；也可选用安全、高效、低残留兽用抗菌药替代产品，如中成药、微生态制剂等，来逐步遏制动物源细菌耐药、兽药残留超标等不利影响。

参考文献

[1] 夏良华. 牛无乳链球菌的危害、检测方法及防治[J]. 中国畜牧兽医文摘， 2016，32（8）：51.

[2] 骆巧， 吕倩， 罗正中， 奶牛场无乳链球菌传播途径新发现[J]. 中国奶牛， 2020(4)：22-24.

[3] 唐义国， 贾红颖. 奶牛无乳链球菌乳房炎的诊断和治疗[J]. 中国乳业， 2020（6）：62-63.

[4] 秦平伟, 张艳, 黄宝银， 奶牛无乳链球菌乳房炎研究进展[J]. 畜牧兽医杂志, 2021, 40（6）: 105-108.

[5] 孟肖潇, 吴建勇, 洪都孜·波拉提， 牛源无乳链球菌对喹诺酮耐药的基因特征[J]. 福建农林大学学报, 2023, 52（3）:359-364.

[6] 陈杰. 新疆16个规模化奶牛场致乳房炎主要病原菌的检测与防控[D]. 石河子: 石河子大学, 2022.

[7] 闫新雨. 奶牛乳房炎无乳链球菌的分离鉴定及PCR检测方法的建立[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2022.

[8] 尹金花, 李玫毅, 吴兴， 牛源无乳链球菌分离鉴定与耐药性分析[J]. 中国动物医学进展, 2022, 40(9): 40-43.

基金资助

新疆生产建设兵团十二师重点领域科技攻关项目(SRS2022013)

新疆维吾尔自治区奶产业技术体系(XJARS-11)

新疆维吾尔自治区科技厅自然科学基金面上项目(2021D01A40)