化皮刺参组织中盾纤毛虫的分离与鉴定

Isolation and identification of scuticociliate in the tissues of ulceration epidermis of Apostichopus japonicus.

摘要

目的 对化皮刺参（Apostichopus japonicus）病例中的寄生虫进行分离鉴定，分析其致病因素，为刺参盾纤毛虫病诊断和防控提供参考依据。 方法 对辽宁某养殖场送检的化皮刺参表皮、体壁、肌肉、体腔液、呼吸树、肠道进行镜检，将观察到的纤毛虫离体培养，并进行18S rDNA测序。 结果 病参各组织器官观察到纤毛虫H-1、H-2、H-3和H-4，H-4通过形态学判断为后口虫，成功离体培养出H-3与镜检未观察到的H-5。纤毛虫H-3与H-5的18S rDNA序列比对结果显示为海洋尾丝虫（Uronema marinum）。 结论 本病例中刺参各组织寄生多种纤毛虫，体腔液中寄生海洋尾丝虫，呼吸树中寄生后口虫和海洋尾丝虫。

关键词

化皮刺参 / 盾纤毛虫 / 18S rDNA / 离体培养 / 后口虫 / 海洋尾丝虫

Key words

Apostichopus japonicus / scuticociliate / 18S rDNA / culture in vitro / Boveria Stevens / U.marinum

刺参（Apostichopus japonicus）分布于我国北方沿海，被誉为海八珍之一，其可食用部分含有丰富的蛋白质、氨基酸和黏多糖，具有很高的营养和药用价值^[1]。随着刺参市场需求量增加及其自然资源减少，刺参养殖业迅速发展，养殖技术逐步成熟，养殖规模和养殖密度不断扩大，养殖刺参的病害问题也日益增多。

养殖刺参的流行病中，“烂边病”“溃烂病”“腐皮综合征”“后口虫病”和“化板症”均会引起刺参化皮，最终导致死亡^[2-4]，已报道的病原主要包括弧菌属（Vibrio）、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）和气单胞菌属（Aeromonas）细菌^[5-6]，以及后口虫属寄生虫^[7]。盾纤毛虫属于纤毛动物门（Ciliophora），寡膜纲（Oligolymenophorea），盾纤亚纲（Seuticoitiatia），在海洋中广泛存在，营自由生活或寄生生活。已知能感染海洋动物的盾纤毛虫有：后口虫，属盾纤目（Scuticociliatida），鱼钩虫科（Ancistridae Issel），后口虫属^[7]；海洋尾丝虫（Uronema marinum），属嗜污目（Philasteridae），尾丝虫科（Uronematidae），尾丝虫属（Uronema）^[8]；水滴伪康纤虫（Pseudocohnilembu persalinus），属嗜污目，嗜污科（Philasteridae）伪康纤虫属（Pseudocohnilembus）^[9]；贪食迈阿密虫（Miamiensis avidus），属嗜污目，嗜污科，迈阿密虫属(Miamiensis)^[10]。盾纤毛虫虫体多为瓜子形或柱形，一般有1个可见的核，体表长有纤毛作为运动器官。在海洋动物健康状态不良时，盾纤毛虫可侵入动物体内寄生^[11]，其宿主包括大菱鲆、大黄鱼、红鳍东方鲀、海马等鱼类^[12-15]，以及刺参等棘皮动物^[16]和对虾等甲壳类^[17]。盾纤毛虫的寄生行为可造成宿主组织器官的结构受损或失去正常功能，引起继发性细菌感染与炎症，最终导致宿主死亡。目前，关于其他属种盾纤毛虫引起刺参化皮的报道较少^[16]。本研究对辽宁某养殖场送检的化皮刺参表皮、体壁、肌肉、体腔液、呼吸树、肠道进行镜检，将观察到的纤毛虫离体培养，并进行18S rDNA测序，测序结果于NCBI数据库中进行BLAST比对分析，通过形态学及分子生物学方法鉴定化皮刺参各组织器官中盾纤毛虫的种类，以期为刺参盾纤毛虫病的诊断防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病参为2023年4月辽宁省瓦房店市某刺参养殖场送检样品。每100 mL灭菌海水加入1 g海水鱼肉，煮沸5 min，纱布过滤后加入100 μL青链霉素混合液100×（北京索莱宝科技），即配制成纤毛虫离体培养基。

1.2 纤毛虫的离体培养

无菌24孔板中加入离体培养基2 mL/孔，取化皮刺参体腔液、表皮、体壁、肌肉、呼吸树和肠道进行镜检，用1 μL微量移液器于镜下分别吸取纤毛虫加入孔板。在16 ℃下静置培养2 d后逐孔镜检，将繁殖后的纤毛虫转移到锥形瓶中传代培养。

1.3 总DNA提取

离心收集纤毛虫（3 000 r/min)，使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒DP324（北京天根生化科技）提取总DNA。DNA提取产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将条带清晰的总DNA进行18S rDNA扩增。

1.4 18S rDNA扩增与测序

选用18S rDNA通用引物，上游引物F：5'-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'，下游引物R：5'-TGATCCTTCTGC AGGTTCACCTAC-3'；反应体系25 μL：2.5 μL 10×PCR缓冲液，0.5 μL 10 mmol/L 4×dNTP（上海生工生物工程），0.2 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶（上海生工生物工程），上、下游引物各1.0 μL（浓度7 μmol/L），模板DNA 1.0 μL（质量浓度1.8 μg/mL），ddH₂O补足终体积至25 μL。

PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，59 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min（42次循环）；72 ℃延伸5 min；4 ℃结束。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后，将条带清晰明亮的扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI数据库中BLAST比对分析。

2 结果与分析

2.1 化皮刺参镜检

根据纤毛虫在化皮刺参中寄生部位与形态的不同，将纤毛虫编号为H-1、H-2、H-3和H-4。表皮组织镜检可见纤毛虫H-1（图1A），虫体长柱形，体被微小纤毛，可见体内胞质。体壁组织镜检可见纤毛虫H-2（图1B），虫体卵形，体被短纤毛，可见体内胞质。体腔液镜检可见纤毛虫H-3（图1C），虫体瓜子形，体被纤毛，体内除胞质外，可见数个食物团。呼吸树镜检可见纤毛虫H-4（图1D），虫体呈火炬形，体被短纤毛，体内可见核、食物团和胞质。虫体前端圆钝，可附着在刺参呼吸树壁上，后端宽大不规则，有明显口部，口部周围分布着长纤毛。H-4的形态与荣小军^[7]报道病例中的类唇后口虫高度吻合，且其寄生部位、寄生方式、组织特异性以及生活方式与类唇后口虫（Boveia cf.labialis）一致，因此推断H-4为1种后口虫属盾纤毛虫。后口虫在病参呼吸树内观察到的数量最多，认为是引起刺参盾纤毛虫病的病原之一。本病例刺参肌肉和肠道组织均未检出寄生虫。

2.2 纤毛虫离体培养

H-1、H-2和H-4均无法离体培养，虫体H-3离体培养2 d后可繁殖同种纤毛虫（图2A），并可扩培。H-4离体培养组未得到H-4，得到与H-3形态和运动方式极为相似的纤毛虫，根据编号顺序编为H-5（图2B），H-5可离体扩培。

2.3 纤毛虫18S rDNA测序与鉴定

纤毛虫H-3、H-5总DNA电泳结果见图3A，条带清晰明亮，可以用于18S rDNA扩增。18S rDNA扩增产物电泳结果见图3B，与高延奇等^[18]报道的纤毛虫18S rDNA电泳条带位置一致，可用于测序。测序结果经BLAST比对显示，H-3扩增片段（1 684 bp）与海洋尾丝虫Uronema marinum（MF992242.1）一致性高达99%，H-5扩增片段（1 681 bp）与海洋尾丝虫Uronema marinum（MF99240.1）一致性高达99%，表明二者均为海洋尾丝虫。

3 讨论

近年来，辽宁地区刺参养殖场频发盾纤毛虫病，在春夏交际时造成刺参大量死亡，已成为危害辽宁地区刺参养殖业的疾病之一。以往对刺参盾纤毛虫病的报道较少，王印庚等^[16]镜检病参观察到大量盾纤毛虫，通过形态学鉴定为嗜污目盾纤毛虫。荣小军^[7]通过对病参各组织器官进行镜检，仅在呼吸树中发现盾纤毛虫并通过形态学鉴定为类唇后口虫。后口虫寄生在刺参呼吸树，病情严重时呼吸树内外壁均有大量后口虫固着，可导致病参出现排脏反应，免疫力降低。在这种情况下，刺参不仅生长受到限制，还极易继发感染其他疾病导致死亡。目前，盾纤毛虫的分类、生活史、流行规律和致病机制等尚不明确，仍有待科研工作者和从业人员深入研究。

本研究从化皮刺参各组织镜检到纤毛虫H-1、H-2、H-3、H-4，仅H-3、H-5可离体培养，原因可能是不同种纤毛虫的生活史与组织专一性不同。H-1与H-2的形态与以往病例报道中感染海洋动物的盾纤毛虫均不同^[13]，二者可能仅在刺参组织中生存，但不是造成刺参盾纤毛虫病的病原。因无法获得大量纯化的H-1与H-2，故未进行分子生物学鉴定，二者生物学特征和具体生活史还需进一步研究。盾纤毛虫这一类原生动物在生存环境变化或自身生理状态转变时，会形成包囊，虫体由活动状态变为静止不动，细胞团缩并失去某些结构，包囊又会在环境适宜时脱包囊，恢复正常的活动^[19]。荣小军^[7]在病参呼吸树上观察到大量的包囊，并且有大量包囊存在的病参中类唇后口虫的检出率很高，推测类唇后口虫进入刺参呼吸树的方式是通过孢子囊而不是虫体直接侵入，其虫体在海水中不能营自由生活。后口虫无法离体培养，推测其寄生生活十分依赖刺参呼吸树提供的理化环境并对刺参呼吸树有很强的组织专一性。

H-3、H-5经鉴定为海洋尾丝虫，其危害牙鲆^[20]、大菱鲆^[21]、红鳍东方鲀^[22]等鱼类，主要寄生在上述鱼类的皮肤、肌肉和鳃组织。海洋尾丝虫寄生刺参的研究较少，高延奇等^[18]于2021年在刺参体表溃烂处分离鉴定出海洋尾丝虫，本文在病参体腔液与呼吸树中分离到海洋尾丝虫并成功离体培养。王印庚等^[16]在病参体内镜检到瓜子形盾纤毛虫，并通过形态学鉴定其属嗜污目。本研究以形态学为基础，通过分子生物学方法鉴定出病参体腔液及呼吸树中的纤毛虫为海洋尾丝虫和后口虫，进一步完善了海洋尾丝虫在刺参上的寄生部位，确定其为刺参盾纤毛虫病的病原之一，为刺参盾纤毛虫病诊断防控提供了参考。

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基金资助

辽宁省教育厅高等学校基本科研项目(LJKMZ20221121)