重组酶介导等温扩增技术在动物疫病检测中的应用

摘要

重组酶介导等温扩增技术（RAA）是一种新型核酸扩增技术，能在简单设备甚至低资源环境下实现等温快速扩增；具有特异性强、灵敏度高、操作简便、耗时短等优点，适用于动物疫病快速检测。本文介绍了RAA技术的技术原理和技术特点，总结了该技术在动物病毒、细菌、寄生虫、动物源性产品和其他病原微生物等多个领域中研究现状。同时，提出了该技术存在的不足和展望了未来的发展方向和热点。

关键词

重组酶介导扩增 / 疫病检测 / 应用 / 动物源性产品 / 病原微生物

随着核酸体外扩增技术的深入研究和发展，在恒温条件下使核酸在体外得到扩增，其中重组酶介导等温扩增技术（recombinase aided amplification，RAA）是讨论和研究最多的一项新技术。该技术是中国学者在英国TwistDx生物技术公司发明的重组酶聚合酶等温扩增技术（recombinase ploymerase amplication，RPA）基础上于2010年独立自主研发出的一种在常温条件下的新型核酸扩增技术，这是一次技术上的全面革新。

RAA技术较传统PCR技术优势有：①温度条件简单。在37～42 ℃常温环境下即可反应。②检测时间短。反应过程一般在15～25 min。③检测结果灵敏度高，扩增产物可达10¹²数量级。该技术将代替传统的PCR技术^[1]。

本文拟从RAA技术原理、技术特点、在动物病毒、细菌、寄生虫、动物源性产品和其他病原微生物等多领域的检测应用方面进行综述，以期为今后相关的深入研究提供参考。

1 RAA技术原理

特异性的上下游引物与重组酶作用形成引物-重组酶复合体，该复合体与靶标DNA中的同源序列识别和配对，当同源序列被识别或特异性位点被定位，双链被重组酶解链，引物和DNA模板链交换，并启动DNA合成反应，进而使特定的目标DNA序列进行扩增；为防止新链和母链配对，引物的3′端被重组酶解离后将被解链置换聚合酶识别，进一步启动扩增反应后复制延伸。

RAA技术有别于RPA技术的创新点是在于扩增反应中使用的重组酶来源比较广泛，主要来源是稳定性更好的细菌或真菌而不是噬菌体；且对温度的适应性也更强，一般在常温下37～42 ℃即可进行反应。RAA引物长度一般在25～35 bp较PCR引物长，与重组酶的结合效率较高，不易产生复合二聚体，因此不会有较高的阳性率。RAA引物的序列3′端最好为C或G，其含量控制在30%～70%；5′端最好为C且避免出现重复G和C。引物设计时，下游引物5′端标记生物素（biotin）；在探针大于30 bp处标记四氢呋喃（THF）或四氢呋喃的衍生物（dSpacer），3′端标记C3Spacer/Biotin-TEG。在实际操作当中，一般会对一个靶标基因的一系列的候选引物优化且筛选出最佳的引物对。在RAA反应体系中，最佳目的基因长度一般为80～200 bp，序列片段相似度小于64%为宜，以防止非特异性扩增^[2-4]。

2 RAA技术特点

2.1 技术优势

第一，靶标DNA扩增过程不需要高温且扩增产物可达10¹²数量级增长。

第二，该技术不受点样孔数量和时空的限制，适用于动物疫病发生的现场检测；可替代PCR仪，从而实现了基层兽医便携式在临床快速核酸检测。

第三，灵敏度高，检测耗时短，一般在10～20 min内即能完成指数级的扩增反应^[5-6]。

第四，特异性强，检测结果与实时荧光定量PCR的结果无显著性差异。

第五，RAA技术检测成本较传统PCR技术优势巨大，同时也降低了操作设备的专业性和复杂性，利于基层兽医临床诊断。

第六，RAA技术可衍生出多样化的检测形式，如：琼脂糖凝胶电泳检测、实时荧光RAA（fRAA）、与侧向流层析技术（LFD）结合、与CRISPR 技术结合衍生的CRISPR-Cas13a/Cas12a辅助RAA法、逆转录重组酶介导核酸扩增法RT-RAA等新技术，从而极大地增强了RAA技术的检测能力和应用范围^[7]。

2.2 技术缺点

第一，由于RAA技术发展较新，在引物设计上积累的经验不够多，专业性也不强，因此目前应用的领域也有限。

第二，由于检测样品的成分和复杂程度有差异，会影响检测结果特异性和稳定性，因此在实际操作中，可与免疫学和分子生物学相结合，建立适宜的样品前处理程序或流程。

第三，因前期样品处理不当，试验结果和实际检测中假阳性的比例较高，所以在整个过程中要减少受到气溶胶污染因素，同时也要防止交叉污染的发生。

第四，反应过程中由于目标基因的序列长度较短，扩增过程中非特异性产物极易产生^[8]。

第五，反应体系中某些因素会造成引物二聚体的形成，如：引物过剩、引物设计不合理、检测微量DNA等^[9]。

第六，样本成分或基质的差异化，可使检测结果出现假阴性，进而影响判断。因此，作为扩增内标的管家基因（house-keeping genes）在实际操作中引入就显得尤为重要，以期减小假阴性概率，进而提高检测准确度^[10]。

第七，RAA技术反应后的体系中存在大量蛋白酶，任何一种酶的活性变化其影响都是巨大的；若在扩增产物检测前不对相关检测载体（如：AGE）做前处理，都会影响扩增条带观察，干扰结果判断^[11]。

3 RAA技术的应用

3.1 动物病毒检测

目前RAA技术已被广泛应用于动物病毒检测方面。2020年杜秋明等^[12]成功地利用RAA技术于20 min内在常温下检测出猪附红细胞体且最低检出限为1 copy/μL，与荧光定量PCR方法检测结果一致；该方法具有良好的特异性和敏感性，操作简便可应用于临床快速检测。邵建宏等^[13]采用RAA技术分别成功地建立了猪肺疫和猪丹毒检测方法，其检测时间也是20 min，且2种方法相应质粒的检测灵敏度均为2.55×10² copy。

上述检测法经特异性试验表明与丹毒杆菌和巴氏杆菌不存在交叉反应；但对单核细胞增生李斯特菌、猪Ⅱ型链球菌、支气管败血波氏杆菌、金黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌等猪源细菌性病原微生物呈显著性差异。2020年，王文静等^[14]根据禽流感病毒（AIV）保守基因（NP）序列设计引物和探针，利用RT-RAA技术对NP序列进行快速扩增且可通过侧向流试纸条（LFD）用肉眼观察达到快速检测目的，成功地建立了1种能够检测禽流感病毒的RT-RAA-LFD检测方法。该方法在37 ℃条件下，24 min内即可实现NP目的基因片段的有效扩增，与传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性喉气管炎病毒（AILV）、新城疫病毒（NDV）均无核酸交叉反应；敏感性达到10² copies/μL，是常规PCR的100倍，临床检测符合率为94.8%。该方法特异性强、敏感性高、便捷快速，为现场检测禽流感病毒提供一种可行方法。2021年吴江等^[15]对猪圆环病毒3型建立了实时荧光-RAA检测法，其法在39 ℃下对115份猪病样品于20 min内的最低检测拷贝数均为530 copies/μL，与传统PCR方法一致。

3.2 动物细菌病原及抗性基因检测

目前RAA技术在动物源细菌的检测方面具有很高的敏感性，笔者认为实际操作中应据不同目标细菌基因组含量而考虑增菌因素，增菌后相较直接提取核酸检测的检出率和结果符合率更高。2023年杜秋明等^[16]利用RAA荧光检测法成功地检测出多杀性巴氏杆菌，其特异性试验表明与新孢子虫、副猪嗜血杆菌、猪大肠杆菌和猪附红细胞体等病原菌均不表现交叉反应；该法对45份病料的检测阳性率为33.33%，最低检出限为10 copies/μL，其结果与荧光定量PCR法相符。2019年，葛以跃等^[17]以基因编辑工具（CRISPR-Cas13a）为基础对副溶血性弧菌建立了一种RAA检测方法，该法对病样的检测阳性率与real-time PCR的检测结果相符合，且与其他病原微生物之间无交叉反应。姚丽锋等^[18]利用RAA技术对动物源产品中铜绿假单胞菌的含量的进行检测研究，检出限与传统检测方法一致；同时表明此法特异性良好，与食源性产品中其他病原菌无交叉反应。

RAA技术在抗生素抗性基因检测方面的研究相对较少，但就目前已有的研究而言，笔者认为其上述领域未来可期。2022年，车勇良等^[19]根据黏菌素耐药基因（mcr-1）的保守区序列特异性地设计RAA引物和荧光探针，其建立的RAA检测法特异性和敏感度均良好，于21 min能对4株大肠埃希氏菌样品有效检测出mcr-1基因。2023年，周志祥等^[20]针对四环素抗性基因（tet A）的保守区序列设计且优化RAA引物，且对18份环境样的抗性检测阳性率为100%，同时与其他无抗性细菌均无交叉反应。

3.3 动物寄生虫病检测

近年来RAA技术已逐渐成为一种新型的检测技术手段应用于动物寄生虫方面的快速检测和防治方面^[21-22]。2020年，张强等^[23]将广州管圆线虫的ITS1基因序列作为靶标序列进行特异性引物设计且建立的荧光-RAA快检法灵敏度较高，其扩增产物特异性地区别于曼氏血吸虫、华支睾吸虫、十二指肠沟口线虫和小管福寿螺等寄生虫。

在进出口检验检疫方面，唐慧骥等^[24]利用RAA技术对河南省口岸截获的17种萝灰粉蚧的线粒体COI基因序列进行特异性引物筛选且优化反应条件，最终建立了一种RAA技术检测新菠萝灰粉蚧的方法，其目标基因最低限值为1.6×10^-3 μg/mL。2022年，邵雷等^[25]基于RAA技术针对疟原虫属18S rRNA序列设计特异性引物，且优化了扩增体系，建立了相关检测体系，该法与其他血源型寄生虫没有交叉反应且特异性良好。赵松等^[26]采用RAA技术对曼氏血吸虫某段高重复区序列进行引物设计和合成荧光探针，成功建立了灵敏度高、特异性强的荧光-RAA检测反应体系。2020年，丁昕等^[27]针对细粒棘球绦虫的12S rRNA序列进行设计和优化，合成特异性RAA引物和荧光探针且成功建立了荧光-RAA检测法；其特异性试验结果表明对日本血吸虫、十二指肠钩虫、牛带绦虫和多房棘球绦虫等无阳性反应，其最低检测限为10 copies/μL。同样，2021年，张学勇等^[28]以线粒体基因组序列为靶标物，对多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫等3种绦虫分别设计RAA引物和扩增目标序列，成功地建立了多重RAA检测方法并优化相关条件。

3.4 动物源性食品安全

动物源性食品质量和安全性是民生问题，肉制品的造假和掺假问题屡见不鲜，适宜的检测手段成为动物源性制品成分的检测的难点和热点。郭燕华等^[29]基于牛线粒体细胞色素B基因（CyB）序列和苗丽等^[30]以鸡线粒体细胞色素B基因（CyB）序列设计RAA引物和探针，分别成功地对牛源性牛肉制品和鸡源性鸡肉制品建立了检测方法，结果表明该法不仅可用于鉴别肉制品中的牛源性的成分，而且可特异性地对乌鸡、芦花鸡、高山鸡和野鸡等鸡源性肉制品的基因组DNA扩增。随着新技术的发展和交叉应用，周新丽等^[31]针对5种动物源性成分成功地研制出了一套新型快检系统，该新系统将RAA技术、离心驱动原理、流体控制平台、光电检测技术和恒温控制技术等有效地融合在一起，其检测结果表明特异性强、灵敏度高、不同动物源性样本间无交叉反应。

3.5 动物源其他微生物检测

目前，RAA-LFD法的检测灵敏度较高，与传统PCR法和实时定量PCR法相比较，其一致率分别为95.3%和98.4%。2022年，Jiao等^[32]采用RAA-LFD法对鹦鹉热衣原体进行检测，其灵敏度高，最低检测限为10 copies/μL。在常温条件下，已对滑膜支原体（MS）建立了RAA-LFD检测法，可利用LFD快捷准确地观察到扩增产物，且与禽呼肠孤病毒（ARV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）、鸡败血支原体（MG）、新城疫病毒（NDV）、大肠杆菌（E.coli）和多杀性巴氏杆菌（P.multocida）均没有交叉反应^[33]。

4 前景与展望

RAA技术作为常温核酸扩增技术的典型代表，已打破了传统检测技术手段在设备依赖、人员专业技能、地域空间、能源等多因素的限制。在国内目前基层兽医领域，该技术可用于养殖场中动物疫病感染早期的检测、诊断和防控，以减少业主的经济损失，在此领域中其应用潜力和商业价值巨大。鉴于兽医领域对现场快速检测（point-of-care-test，POCT）的需求日益强烈，随着各种新技术的发展和突破，靶标对象和领域也势必扩大或升级。同时，多技术和多学科融合型的新型快检新产品将陆续被研发问世，其必将在兽医领域发挥更大的作用。由于以重组酶介导扩增技术为基础的检测手段具有一定的开放性，可与不同的分子生物学、蛋白组学和免疫学等学科相结合，衍生出不同形式的快速检测技术。

笔者认为该技术未来首先在“靶标物提取-扩增-检测-显示-诊断”五步一体化的操作方面是发展的重点；其次，根据中国养殖业和兽医领域的特点，在便携式、小型化和试剂盒等形式上的产品具有巨大提升和改良空间；再次，该技术可结合影像图文技术、远程控制技术和多通道检测等技术领域，以期在更多方面实现新的突破，可能将应用于某些极端自然资源环境地区，如：远洋渔业、深海探测、极寒地带的高海拔地区和戈壁无人区等方面；在这些特殊环境下，动物医学工作者可在相关动物疫病的快速检测、诊断和防控方面进行更为广泛的应用。

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基金资助

四川省区域创新项目(2023YFQ0037)

四川省区域创新项目(2024YFHZ0110)

四川省重大科技专项(2021ZDZX0010)

国家现代农业体系四川创新团队建设项目(sccxtd-2024-08)

财政运行专项(SASA2024CZYX0006)

四川省科技计划项目(2021YFYZ0030)