牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）是一种对全球牛养殖业影响巨大的重要病毒之一，也常被称为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（bovine viral diarrhea-mucosal disease, BVD-MD)，世界动物卫生组织（WOAH）将其列为法定报告病因，中国农业农村部将牛病毒性腹泻病列为三类动物疫病。BVDV属于单股正链 RNA 病毒，该病毒不仅可以感染牛，并且能在多种家畜和野生动物中持续感染，包括绵羊、山羊、猪、白尾鹿、骡鹿、大羚羊、鼠鹿、羊驼等
[1-2]。患病牛会出现严重腹泻、胃肠道黏膜溃疡、产奶量下降等临床症状
[3]。其中，感染BVDV的妊娠母牛会出现流产、产死胎、产畸形胎的临床症状。另外，BVDV通过诱导免疫抑制从而提高了感染其他病原微生物的可能性
[4]。BVDV的传播导致牛的繁殖性能降低、犊牛成活率下降、肉牛料肉比降低，增加了控制和根除疫病方面所产生的费用，直接或间接地影响畜牧业的发展，给我国养牛业造成持续严重的经济损失。本文就流行现状、病原学特征等对牛病毒性腹泻病进行综述，为临床防控、诊断技术开发等提供理论依据。
1 BVDV的流行现状和趋势
1.1 BVDV国外流行现状
BVDV最早被发现于1946年的北美地区，随后于1971年才被正式命名。从20世纪80年代到90年代期间开始，全世界各地陆续开展了BVDV相关的流行病学调查，调查结果表明全世界各地总体阳性率均达到50%以上，另外，有文献指出，全球除南极洲以外，其他六大洲均有报道BVDV的相关病例，其中涉及88个国家
[5]，这两者均证明了BVDV传播范围广泛。在国外的调查中显示，BVDV每年造成的经济损失为0～552英镑/头奶牛，平均经济损失为46.50 英镑/头奶牛。有学者对2010－2021年间与BVDV相关的文献进行了统计汇总，结果表明欧洲的抗原阳性率最高，达到了23.27%，其次是亚洲达到了16.75%，最低为北美0.32%。另外，在统计的结果中，学者对各个国家抗原阳性率同样进行了统计，其中西班牙的抗原阳性率在所有国家中最高，印度的抗原阳性率最低
[6]。由于传播范围广泛以及危害严重等原因，英国、美国以及其他欧洲部分国家制定了相应的防控和根除计划
[7]，目的是降低BVDV每年所造成的经济损失。
1.2 BVDV国内流行情况
BVDV传播范围广泛，跨国贸易的发展，为BVDV传入国内提供了条件。20世纪80年代，李佑民等
[8]首次从胎牛血清中成功分离出BVDV，并在河北、新疆、黑龙江、天津和青海等地持续检测到。随后我国于1995年首次分离出猪源中国BVDV-1毒株ZM-95，在2009年首次分离到 BVDV-2a 型毒株 SD06，为研究的深入提供条件。和彦良等
[9]对2018－2021年在辽宁、吉林、河北等8个省份所采集的样品进行了检测，结果发现所调查区域BVDV抗体阳性率和核酸阳性率均呈上升趋势，抗体阳性率介于70.95%～90.03%，核酸阳性率介于1.17%～20.71%。张丁中等
[10]针对青藏高原犊牦牛腹泻的病原进行了流行病学调查，结果表明青海、四川、西藏这3个省份BVDV-1阳性率分别为30.88%、27.34%、15.26%，并且存在着与其他病原的二重、三重、四重感染。BVDV在我国不仅会感染猪和牛，还会引起羔羊感染且发病率和死亡率较高。Li等
[11]对江苏省6个地区采集的236份山羊血清进行流行病学调查，结果显示山羊患病率达到12.3%。目前，在中国不同地区，牛、猪、羊、骆驼和梅花鹿的BVDV感染均有报道。夏九鲜等
[12]对云南部分地区的猪场进行了流行病学调查，其研究结果表明无论是散养户还是规模化猪场都存在BVDV的感染，其阳性率分别为16.67%和5.83%。综上所述，可见BVDV在我国传播范围广泛且宿主种类多，意味着BVDV感染在中国动物种群中的流行情况非常复杂，对养殖业造成了重大的经济损失。
2 病原学特征
BVDV是一种单股正链 RNA 病毒，属于黄病毒科瘟病毒属，病毒形态类似球形，病毒大小在20～60 nm，基因组约为 12.3 kb。它的基因组包含1个开放阅读框（ORF），该开放阅读框可编码4种结构蛋白（C，E
rns，E1，E2）和8种非结构蛋白（N
pro，p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B）
[13]。开放阅读框的两侧是 5'-UTR和 3'-UTR。但是由于用5'-UTR来区分BVDV 基因型和亚型对病毒进行分类存在着一定的不准确性或者统计学意义不佳，研究人员设计了针对 BVDV-1 的 NS3-NS4A和 BVDV-2 的 NS5B的新型引物组来区分 BVDV的亚型。也正是这一种方法准确地再现了来自GenBank的所有118个BVDV-1和88个BVDV-2完整/接近完整基因组（CNCG）的亚型。根据不同基因型可将BVDV分为3类，分别是BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3，其中BVDV-3是在巴西、东南亚等地分出来的一种新的BVDV。另外，目前BVDV-1包含至少 22 种亚型（1a-1v），BVDV-2 包含至少 4 种亚型（2a-2d）
[14]。BVDV存在着2种生物型，分别为细胞病变型（CP）和非致细胞病变型（NCP），其中较为常见的生物型是非致细胞病变型，并且非致细胞病变型更容易引起牛流产，而细胞病变型不常见，通常与黏膜疾病暴发有关。BVDV对于低温不敏感，但是在温度大于40 ℃时BVDV的感染力会下降，在56 ℃时会失活。有研究表明，在37 ℃的环境温度下，BVDV会在胰蛋白酶作用60 min后失活。另外，BVDV对酸性环境存在一定的抵抗力。
3 临床症状及病理变化
3.1 急性感染
急性感染最为常见，多发生于幼龄动物。急性感染的动物表现为体温升高、食欲不振、嗜睡和产奶量降低等。由于传播途径多为呼吸道，因此病毒最先侵袭的部位为口腔和鼻，所表现的症状为口鼻糜烂和溃疡。随后由呼吸系统和消化系统蔓延至全身，症状表现为咽部、喉部和食管出现严重和广泛的溃疡、出血性肠炎、腹泻以及白细胞减少。子宫内感染BVDV会导致怀孕母牛流产。另外，该病会侵袭免疫器官导致机体免疫力下降、淋巴细胞凋亡
[15]。
3.2 慢性感染
慢性感染主要表现为怀孕母牛早产、流产、产死胎，感染后期会引起牛跛行或行走困难
[16]。
3. 3 持续性感染
当怀孕母牛在妊娠早期（40～125 d）感染非致细胞病变型BVDV，而后BVDV透过胎盘屏障导致胎儿在体液免疫系统发育前感染该类BVDV，并且产下的犊牛终生带毒并持续排毒，这类情况称为持续感染，这类牛又称PI牛。由于该类牛无法产生相应的抗体，也就无法通过检测抗体的方式进行监控，从而对于牛群的健康有严重危害
[16]。
4 诊断
4.1 病毒分离鉴定
分离病料中的BVDV进行培养和鉴定是目前实验室最常用的鉴别诊断的方法之一，同时被认为是BVDV诊断的“金标准”。病料可以是患病动物的血液、脏器、粪便等。对于采集到的病料，可采用相应的方法进行处理，随后使用原代细胞进行感染并进行培养
[17]。据文献报道，牛子宫内膜细胞、牛睾丸细胞、牛肾细胞、牛鼻甲细胞、牛支气管上皮细胞、牛肺细胞和牛皮肤成纤维细胞均可用于BVDV的分离。其中，牛肾细胞、牛睾丸细胞和牛鼻甲细胞是目前用于BVDV分离的最广泛原代细胞。此外，BVDV 分离株可在牛肾（MDBK）、牛扁桃体（BoTur）和仓鼠肾（BHK）细胞系中进行体外培养。由于MDBK 更容易感染BVDV，通常用MDBK来培养BVDV，所呈现的病变则是MDBK细胞出现变圆、间隙增大、胞浆出现空泡，最后出现“蛛网”现象
[18]。
然而，该方法存在着一些缺点，一方面是该方法只能鉴别出细胞病变型 BVDV，而不能识别非细胞病变型 BVDV；另一方面是该方法耗费时间长，不适合处理大批量的样品；还有一方面则是细胞的状态也会对最后结果的判断造成较大的影响。
4.2 酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法（ELISA）是最常用的血清学诊断方法，用于检测某些病原体的特异性抗原或抗体，其优点是该方法特异性高、灵敏度高、重现性好、成本低、操作简单等。ELISA 的主要类型包括间接ELISA、双抗体夹心ELISA和竞争ELISA以及捕获ELISA
[19]。陈瑞红
[20]运用原核表达系统获得了BVDV重组E0、E2和P80三种蛋白，并分别将重组 E0、E2 和 P80 蛋白作为包被抗原建立了三种间接 ELISA 方法，最后对比三种间接 ELISA 方法的特异性和灵敏性。结果显示，该方法特异性良好，BVDV的检测灵敏度分别为1∶640、1∶1 280、1∶1 280，批内和批间变异系数均小于10%，与病毒中和试验相比，以重组蛋白 P80 为包被抗原的间接 ELISA 方法的符合率最高，为96.5%；重组蛋白 E2 作为包被抗原的间接 ELISA 方法次之，为 95.1%；以重组蛋白 E0 为包被抗原的间接 ELISA 方法最低，为 88.1%。韩美婧
[21]使用BVDV重组E2蛋白获得了兔抗 E2 蛋白多抗血清和鼠抗E2 蛋白单抗，建立了BVDV 捕获 ELISA 检测方法。结果表明该方法特异性好，检测其他病毒均呈阴性，组内和组间变异系数均小于 5.0%，利用 RT-PCR 方法进行符合性检测，结果显示，牛腹泻粪便样本中的符合率为 99.04%；牛血液样本中的符合率为 98.87%，表明该方法具有良好的特异性、重复性和实践应用性。程艳青
[22]使用BVDV-E2蛋白建立了 BVDV-E2 阻断 ELISA的方法，结果表明该方法灵敏性好、特异性强，为 BVDV 疫苗的抗体监测提供了有力保障。
综上所述，酶联免疫吸附试验既可作为检测病原的方法，也可作为检测接种疫苗牛群中抗体水平的方法，为实际生产中提供便利。但是该方法也存在局限性，一方面制备特异性抗原或抗体存在着一定的难度，另一方面存在假阳性的情况。
4.3 免疫荧光测定
免疫荧光测定（IFA）是一种使用荧光抗体或抗原作为探针来检测未知抗原或抗体的技术
[23]。该方法具有灵敏度和特异性好等优点，但是现如今非特异性染色的问题未被解决，且该方法需要使用到专用荧光显微镜，因此该方法成本高，对于仪器的要求也高，因此不适合基层使用。
4.4 免疫组化
免疫组化（IHC）是一种通过化学反应检测组织中抗原的技术，该化学反应基于抗体与组织切片中特定抗原的结合导致显色剂着色。根据文献的报道，先后有人使用牛的皮肤、口腔黏膜、小肠进行IHC检测
[24]，最终检测出存在BVDV抗原，这也证明了IHC是可以用于BVDV检测的一种方法。此外，由于其不受血液样本中母源抗体的影响，因此可用于PI动物的检测。
4.5 免疫胶体金层析技术
胶体金免疫层析法是一种快速检测方法，该方法将胶体金颗粒作为标记物，以NC膜作为固相载体，利用抗原和抗体的特异性结合的原理来快速分析检测产物
[25]。由于胶体金颗粒具有直接观察和操作便捷的显著优点，胶体金试纸已被广泛应用于各个领域。卜庆龙等
[26]选取BVDV单克隆抗体和兔的金标多克隆抗体用双抗体夹心的方式组装建立了BVDV胶体金免疫层析试纸，与RT-PCR检测的结果进行比较，阴性和阳性总体符合率为88.24%，证明了胶体金免疫层析试纸可用于BVDV的检测，具有广阔的使用前景。
4.6 RT-PCR
逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是一种检测核酸的一种方法，该方法是从组织、细胞、细菌、病毒中提取RNA，使用逆转录酶将其逆转录为cDNA，最后使用cDNA作为PCR扩增的模板。该方法于1991年由Hertig等
[27]首次建立，该方法是基于分别编码NS3和E2蛋白的
p80和
gp53基因进行检测，随后该方法逐渐被广泛应用于BVDV的检测当中。余波等
[28]基于BVDV、BCoV和BRV的参考毒株基因序列建立了一种检测3种病毒的三重RT-PCR方法。在所呈现的结果中，该方法具有良好的特异性，对3种病毒的敏感度高；多次对目的基因进行扩增，所呈现的结果均一致；与单一RT-PCR的结果相一致。RT-PCR的优点在于检测速度快、特异性高、灵敏度高、重复性好，对失活的病毒核酸同样可以检测，并且对于病料的种类没有限制。因此RT-PCR是检测BVDV高效且实用的方法之一。
4.7 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR是一种基于常规PCR所建立的一种方法，该方法与常规PCR不同的是该方法是通过监测荧光基团的数量来对整个PCR过程进行监测，随后可根据仪器绘制的扩增曲线对结果进行判断，同时该方法还可以根据建立的曲线来计算样品的浓度和病毒拷贝数。荧光定量PCR又可分为2种，一种是SYBR Green I染料法，另一种是TaqMan探针法。这2种方法在某些方面存在差异，TaqMan探针法具有更强的特异性，所得到的结果也更为稳定，成本较高。霍晓丽
[29]根据BVDV的5’UTR 基因和BRV的VP6设计引物探针建立了三重荧光定量RT-PCR方法，结果表明其灵敏性强于常规PCR；变异系数小于3%；参考国家检测技术标准和已发表文献中的方法对比，符合率达到 90%以上。荧光定量PCR因其优点可以被用作BVDV的病原检测和定量检测。
4.8 微滴式数字PCR
数字PCR检测方法可被分为3种，其中微滴式数字PCR属于3种检测方法之一。微滴式数字PCR最早于20世纪90年代，该方法目的在单分子水平上定量核酸分子。微滴式数字PCR是一种将PCR与液滴微流控技术相结合的检测方法，该方法可以精确定量样品中的靶分子，以确定靶分子的起始拷贝数。王旭东
[30]建立了一种分别检测 CSFV 和 BVDV 的 ddPCR 检测方法，该方法检测样品中BVDV的最低浓度可达到1.9 copies/μL，证明了该方法具备较高的灵敏度。叶京飞
[31]建立了一步法检测 BVDV 的微滴式数字PCR方法，在结果中检测样品中BVDV的最低浓度可达到3.2 copies/μL，证明该方法同样可以检测BVDV并对病毒进行定量检测。该方法具有许多优点：第一，它并不依赖于扩增曲线的循环阈值，因此也就无需设置标准品；第二，该方法快速、准确，也就有效避免了误报和漏报；第三，该技术不依赖于扩增效率；第四，ddPCR对PCR抑制剂相比较实时荧光定量PCR耐受性更好。这也就证明该方法可以应用于检测病原体、基因突变、基因拷贝数等。
4.9 生物传感器
生物传感器是一种十分高效的工具，可以将难以计算的生物信号转换为可量化的物理或化学信号。由于生物传感器对生物信号具有高度特异性，因此生物传感器被广泛应用于各个领域。Luo等
[32]为快速定量检测大肠杆菌O157：H7和BVDV，采用硝酸纤维素纳米纤维膜的静电纺丝方法研发出了生物传感器，该方法检测BVDV的限度可达到10
3 CCID/mL，且在短短8 min内就能出结果。这证明了该工具的便携性和高效性，对于应用于BVDV的检测有巨大潜力。
5 预防措施
5.1 疫苗接种
由于BVDV与猪瘟病毒同属于黄病毒科瘟病毒属且存在交叉抗原，因此可选用猪瘟兔化弱毒疫苗预防BVDV感染
[33]。另外就是选用BVDV弱毒疫苗或者BVDV灭活疫苗进行预防
[34]。前者多通过连续传代Oregen 和 NADL 标准参考毒株以达到减毒的目的，从而以此制备减毒苗，但减毒苗可能会造成胎儿免疫耐受或者毒力返强的不良反应，因此在使用减毒苗时应制定合理的免疫程序；后者可以规避前者毒力返强的缺点，在疫苗的安全性上相对较高，但灭活苗的免疫效果与地方流行毒株的基因亚型息息相关，且中和抗体衰减快，因此使用灭活苗应注意当地基因亚型再进行选择。
5.2 持续监控
对牛群的健康状况持续监测，比如牛群的体温、免疫后的抗体水平、皮肤黏膜的状况等。另外，PI牛的鉴定尤为重要，因为PI牛是引起牛群感染BVDV的主要原因之一，所以通过检测抗原的方法筛选PI牛并进行淘汰以达到净化BVDV的目的。
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