过瘤胃叶酸对荷斯坦奶牛繁殖性能的影响

Effect of adding rumen-protected folic acid to dietary on the reproduction of Holstein dairy cows

摘要

目的 评价饲粮中添加过瘤胃叶酸对荷斯坦奶牛妊娠率、血浆生殖激素水平和叶酸代谢指标的影响，为荷斯坦奶牛高效利用叶酸提供科学依据。 方法 试验选择体况、胎次与泌乳天数相近的经产荷斯坦奶牛160头并随机分为4组，每组40头，在人工授精前17 d至授精后35 d期间，分别饲喂补充了0、3、6和9 g过瘤胃叶酸的全混合日粮，并在人工授精第35天对试验奶牛进行B超检查，统计奶牛首次配种妊娠率、二次配种妊娠率，并采集血液测定雌二醇（E₂）、孕酮（P₄）、叶酸和维生素B₁₂的浓度。 结果 饲喂3 g过瘤胃叶酸组的首次配种妊娠率、E₂和叶酸浓度显著高于对照组（0 g）；各组的第2次配种妊娠率以及血浆中P₄、维生素B₁₂的浓度无显著差异。 结论 在本试验条件下，饲粮中添加3 g过瘤胃叶酸可提高荷斯坦奶牛首次配种妊娠率以及血浆中E₂和叶酸浓度。

关键词

荷斯坦奶牛 / 过瘤胃叶酸 / 妊娠率 / 繁殖性能

Key words

Holstein dairy cow / rumen-protected folic acid / conception rate / reproductive performance

奶牛繁殖效率与经济效益高度相关。泌乳早期奶牛会进入能量负平衡状态，影响奶牛卵泡发育、黄体功能和生殖道分泌等活动，导致其繁殖性能和免疫力下降^[1-2]。围产期保证奶牛能量和营养充足是母体和胎儿健康的物质基础。叶酸作为一种水溶性B族复合维生素，参与哺乳动物机体嘌呤、嘧啶、DNA蛋白质和核苷酸的生物合成^[3]。补充叶酸可以提高奶牛泌乳早期能量代谢的效率^[4-5]。叶酸是保证胚胎正常发育的必需成分之一，妊娠期母体叶酸的摄入会影响后代的代谢健康^[6]。

早期研究认为，反刍动物瘤胃微生物能够合成叶酸，且足够满足其生长发育需求^[7]。然而，随着研究深入，Girard等^[8]研究结果发现奶牛瘤胃微生物合成的叶酸在围产期和泌乳早期等特殊时期不足以满足机体生长代谢需求，主要原因是在集约化养殖模式下，奶牛饲料原料相对单一，较放牧的青绿饲料叶酸含量偏低，而奶牛瘤胃合成叶酸的能力有限^[9]。据统计^[10-11]，奶牛瘤胃每天合成的叶酸量为16.5~21 mg，而美国NRC标准（2001）指出1头体质量为650 kg、产奶量为35 kg/d的奶牛叶酸需要量为35 mg/d，因此，奶牛自身合成的叶酸已无法满足机体所需^[12]，加之妊娠后，自身叶酸大量转移给子代，处于能量负平衡状态，抵抗外界应激能力下降。此时，需要大量的营养物质补充能量，用于体况恢复，而叶酸具有促进营养物质代谢、抗应激和增强免疫等功能，因此需要在日粮中补充一定量的叶酸^[9]。日粮中添加叶酸能够提升奶牛的繁殖性能^[12]，但由于奶牛体形较大、妊娠期较长，目前关于叶酸在奶牛日粮中的最佳添加剂量和组合方案的研究少有报道。因此，本研究对比添加不同水平过瘤胃叶酸后奶牛繁殖性能和血浆生殖激素及维生素B₁₂浓度的变化，确定最适宜添加剂量，旨在为集约化模式下优化奶牛饲粮营养及改善其繁殖性能提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验于2022年1—6月在宁夏回族自治区上陵牧业有限公司进行，选用体况一致，泌乳天数和胎次相近的健康经产荷斯坦奶牛160头，分为4组，每组40头。由牧场同一工作人员进行人工授精，并在授精后 35 d经直肠超声检查妊娠情况。在人工授精前17 d至授精后35 d期间对4组奶牛分别进行以下处理：①饲喂基础日粮+0 g过瘤胃叶酸；②饲喂基础日粮+3 g过瘤胃叶酸；③饲喂基础日粮+6 g过瘤胃叶酸；④饲喂基础日粮+9 g过瘤胃叶酸。

1.2 试验饲粮及饲养管理

过瘤胃叶酸由山西农业大学提供，依据Ronnenberg等^[13]的方法测定其瘤胃降解率和小肠吸收率分别为21%和80%。试验奶牛的基础饲粮由牧场提供，并以全混合日粮的方式饲喂（表1）。饲喂时将过瘤胃叶酸混合到全混合日粮（TMR）中，并立即投喂奶牛，确保叶酸被完全摄入。试验期间，所有试验奶牛自由饮水，每日饲喂3次，观察试验牛只的采食情况、排泄情况、精神状态以及健康状况，于人工授精后第35天进行妊娠检查，严格做好记录。

1.3 样品采集

在人工授精后第35天的晨饲前，利用含肝素钠的一次性真空采血管对各试验组奶牛进行尾根静脉采血5 mL，每组8头，室温下垂直静置30 min，并于离心机3 000 r/min离心15 min，收集上层血浆并置于－80 ℃冰箱冻存，用于后续试验。

1.4 繁殖性能的测定

在人工授精后第35天，对试验奶牛进行B超妊娠检查，记录并统计奶牛首次配种妊娠率，对首次配种没有怀孕的奶牛进行第2次人工授精，并再次进行B超妊娠检查，统计第2次人工授精后怀孕牛的数量并计算第2次配种妊娠率。

首次配种妊娠率=第1次人工授精以后怀孕奶牛的数量/授配母牛的数量×100%。

第2次配种妊娠率=第2次人工授精以后怀孕奶牛的数量/第2次授配母牛的数量×100%。

1.5 血浆生殖激素指标测定

血浆中雌二醇、孕酮浓度用西门子全自动化学发光分析仪（SIEMENS，Atellica IM 1600）测定，叶酸及维生素B₁₂用靶向代谢组学技术测定，具体操作严格按照说明书进行。

1.6 统计分析

用Excel 2016和Graphpad Prism 8.0软件对数据进行整理和统计分析，导入SPSS软件，对数据进行方差同质性检验。采用一般线性模型对数据进行方差分析，当主效应显著时，采用t检验的多重均值比较。不同试验组的配种妊娠率采用卡方检验多重比较，在α=0.05水平进行显著性分析，血浆中E₂、P₄、叶酸及维生素B₁₂的浓度采用单因素方差分析，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 实验动物有效数据量

试验期间，为了保证数据分析不受疾病因素的影响，剔除了所有淘汰和有发病记录的牛只，最终对129头奶牛的试验结果进行统计（表2）。

2.2 饲喂过瘤胃叶酸对奶牛繁殖性能的影响

由表3可知，饲喂3 g过瘤胃叶酸组的首次配种妊娠率（67.7%）显著高于对照组（37.5%），饲喂6 g和9 g过瘤胃叶酸的首次配种妊娠率与对照组相比无显著差异（P>0.05），添加3、6和9 g过瘤胃叶酸对第2次配种妊娠率均无显著差异（P>0.05）。表明饲喂3 g过瘤胃叶酸能够显著提高荷斯坦奶牛的首次配种妊娠率。

2.3 饲喂过瘤胃叶酸对奶牛血浆中生殖激素分泌的影响

由图1可知，饲喂3 g过瘤胃叶酸组奶牛血浆中E₂浓度显著高于0 g和6 g组（P<0.05）；各组奶牛血浆中P₄浓度无显著差异（P>0.05）。表明饲喂3 g过瘤胃叶酸能显著提高奶牛血浆中E₂浓度。

2.4 饲喂过瘤胃叶酸对奶牛血浆叶酸代谢的影响

根据首次配种怀孕率和激素分泌差异，以及前人研究结果^[14]，进一步对饲喂3 g过瘤胃叶酸组和对照组奶牛的血浆叶酸和维生素B₁₂含量进行测定。由表4可知，与对照组相比，饲喂3 g过瘤胃叶酸组奶牛血浆中叶酸浓度显著高于对照组（P<0.05），2组奶牛血浆中维生素B₁₂浓度无显著差异（P>0.05）。

3 讨论

3.1 过瘤胃叶酸对荷斯坦奶牛妊娠率的影响

奶牛在人工授精后营养需求改变，体内合成的B族维生素已不能满足自身需要。其中，叶酸和维生素B₁₂与生殖功能关系最为密切^[14]。Li等^[11]从产前3周到产后15周给4组胎次和产奶量相近的荷斯坦奶牛的饲粮中添加不同水平的过瘤胃叶酸（RPFA），发现随着RPFA添加剂量的增加（0～3 g），产后150 d内的妊娠率呈线性升高；Juchem等^[14]在泌乳期荷斯坦奶牛饲粮中添加复合B族维生素（含有叶酸），结果发现，与对照组（不添加复合B族维生素）相比，每天添加4 g/头的奶牛首次配种妊娠率提高了4.8%；Morrison等^[15]研究发现，在围产期奶牛饲粮中每天添加复合B族维生素（含有叶酸、钴胺素等）100 g/头，奶牛的不排卵概率降低了12%。本试验研究发现，饲喂3 g过瘤胃叶酸组的荷斯坦奶牛首次配种妊娠率显著高于对照组（P<0.01），与前人研究结果相似，但添加6、9 g过瘤胃叶酸与对照组无显著差异，可能是添加3 g过瘤胃叶酸已满足机体代谢的需要，可有效解决奶牛产后能量负平衡状态。

3.2 过瘤胃叶酸对荷斯坦奶牛激素分泌的影响

奶牛发情前期血清中的E₂浓度升高，诱导P₄受体并抑制催产素受体的活性，阻止黄体过早溶解，有利于胚胎的存活^[16-17]。生长卵泡中的颗粒细胞是产生雌二醇的主要场所，Gagnon等^[18]每周对分娩前24 d到分娩后5 d的荷斯坦奶牛肌内注射叶酸320 mg，试验结果显示，肌肉注射组颗粒细胞中类固醇激素显著提高。Thaler等^[19]研究发现，在叶酸代谢基因MTHFR基因C677T位点存在突变（无法生成活性叶酸）的妇女血清中，雌二醇浓度显著低于正常妇女。本研究结果表明，在饲粮中添加3 g过瘤胃叶酸显著提高了荷斯坦奶牛血浆中雌二醇浓度，这与上述研究结果一致，原因可能是饲粮中添加的叶酸等甲基供体能通过上调卵巢Cyp19A1的mRNA和蛋白表达量，提高雌二醇的浓度^[20]。

3.3 过瘤胃叶酸对荷斯坦奶牛血浆中叶酸浓度的影响

在奶牛饲粮中添加叶酸可以增加血浆中叶酸的浓度^[21]，这与本试验研究结果一致。叶酸代谢途径中形成的S-腺苷蛋氨酸（SAM）介导DNA甲基化和蛋白质合成等过程。甲基转移后，SAM转化为S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）。有研究表明同型半胱氨酸（HCY）浓度过高会导致胚胎发育异常，补充叶酸可以使血浆中的HCY水平降低20%~30%^[22]，原因可能是叶酸代谢途径中产生的5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是调节血浆中HCY水平的一个重要辅因子，MTHFR参与叶酸-甲硫氨酸代谢循环，可将5,10-亚甲基四氢叶酸还原成5-甲基四氢叶酸，后者是外源性叶酸，可作为甲基供体，以维生素B₁₂为辅酶，在甲硫氨酸合成酶的催化下，使HCY再发生甲基化生成蛋氨酸以维持血浆中HCY的正常水平。在荷斯坦奶牛饲粮中添加叶酸提升了首次配种妊娠率的原因可能与过瘤胃叶酸可降低血清中HCY水平有关，但本试验并未对血清中HCY水平进行检测，后续还需进一步探究。

4 结论

在人工授精前17 d至授精后35 d期间，在荷斯坦奶牛饲粮中添加3 g过瘤胃叶酸，对奶牛首次配种妊娠率及血浆中叶酸浓度均有提升效果，并能提高血浆中雌二醇含量。

参考文献

[1] STAPLES C R, THATCHER W W, CLARK J H. Relationship between ovarian activity and energy status during the early postpartum period of high producing dairy cows[J]. J Dairy Sci, 1990,73(4):938-947.

[2] WATHES D C, TAYLOR V J, CHENG Z, et al. Follicle growth, corpus luteum function and their effects on embryo development in postpartum dairy cows[J]. Reprod Suppl, 2003,61:219-237.

[3] CHOI S W, MASON J B. Folate and carcinogenesis:an integrated scheme[J]. J Nutr, 2000,130(2):129-132.

[4] GRAULET B, MATTE J J, DESROCHERS A, et al. Effects of dietary supplements of folic acid and vitamin B₁₂ on metabolism of dairy cows in early lactation[J]. J Dairy Sci, 2007,90(7):3442-3455.

[5] PREYNAT A, LAPIERRE H, THIVIERGE M C, et al. Effects of supplements of folic acid, vitamin B₁₂, and rumen-protected methionine on whole body metabolism of methionine and glucose in lactating dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2009,92(2):677-689.

[6] ROSARIO F J, NATHANIELSZ P W, POWELL T L, et al. Maternal folate deficiency causes inhibition of mTOR signaling, down-regulation of placental amino acid transporters and fetal growth restriction in mice[J/OL]. Sci Rep, 2017,7(1):3982[2024-07-09].

[7] AGRAWALA I P, HUFFMAN C F, LUECKE R W, et al. A quantitative study of rumen synthesis in the bovine on natural and purified rations Ⅲ: riboflavin, pantothenic acid and niacin[J]. J Nutr, 1953,49(4):631-638.

[8] GIRARD C L, MATTE J J. Dietary supplements of folic acid during lactation: effects on the performance of dairy cows[J]. J Dairy Sci, 1998,81(5):1412-1419.

[9] SANTSCHI D E, BERTHIAUME R, MATTE J J, et al. Fate of supplementary B-vitamins in the gastrointestinal tract of dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2005,88(6):2043-2054.

[10] SCHWAB E C, SCHWAB C G, SHAVER R D, et al. Dietary forage and nonfiber carbohydrate contents influence B-vitamin intake, duodenal flow, and apparent ruminal synthesis in lactating dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2006,89(1):174-187.

[11] LI H Q, LIU Q, WANG C, et al. Effects of dietary supplements of rumen-protected folic acid on lactation performance, energy balance, blood parameters and reproductive performance in dairy cows[J]. Animal feed science and technology, 2016,213:55-63.

[12] WANG C, LIU Q, GUO G, et al. Effects of rumen-protected folic acid on ruminal fermentation, microbial enzyme activity, cellulolytic bacteria and urinary excretion of purine derivatives in growing beef steer[J]. Animal feed science and technology, 2016,221:185-194.

[13] RONNENBERG A G, VENNERS S A, XU X, et al. Preconception B-vitamin and homocysteine status, conception, and early pregnancy loss[J]. Am J Epidemiol, 2007,166(3):304-312.

[14] JUCHEM S O, ROBINSON P H, EVANS E. A fat based rumen protection technology post-ruminally delivers a B vitamin complex to impact performance of multiparous Holstein cows[J]. Animal feed science and technology, 2012,174(1-2):16-68.

[15] MORRISON E I, REINHARDT H, LECLERC H, et al. Effect of rumen-protected B vitamins and choline supplementation on health, production, and reproduction in transition dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2018,101(10):9016-9027.

[16] CERRI R L, SANTOS J E, JUCHEM S O, et al. Timed artificial insemination with estradiol cypionate or insemination at estrus in high-producing dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2004,87(11):3704-3715.

[17] 张萌, 王俊奎, 杨玉东， 人工授精后不同阶段葡萄糖、孕酮和雌二醇含量对奶牛妊娠预测的研究[J]. 中国畜牧杂志, 2020,56(10):108-111.

[18] GAGNON A, KHAN D R, SIRARD M A, et al. Effects of intramuscular administration of folic acid and vitamin B₁₂ on granulosa cells gene expression in postpartum dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2015,98(11):7797-7809.

[19] THALER C J, BUDIMAN H, RUEBSAMEN H, et al. Effects of the common 677C>T mutation of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene on ovarian responsiveness to recombinant follicle-stimulating hormone[J]. Am J Reprod Immunol, 2006,55(4):251-258.

[20] DUPLESSIS M, LAPIERRE H, PELLERIN D, et al. Effects of intramuscular injections of folic acid, vitamin B(12), or both, on lactational performance and energy status of multiparous dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2017,100(5):4051-4064.

[21] CHAKRABORTY P, GOSWAMI S K, RAJANI S, et al. Recurrent pregnancy loss in polycystic ovary syndrome: role of hyperhomocysteinemia and insulin resistance[J/OL]. PLoS One, 2013,8(5):e64446[2024-07-09].

[22] 杨娟娟. 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性与原因不明复发性流产相关性的Meta分析[D]. 南宁： 广西医科大学, 2019.

基金资助

2023年银川市产学研融合助力农业高质量发展项目

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