养殖废水高效降臭微生物筛选及组合菌剂的研究

Screening microorganisms with efficient deodorization and the combination of microbial agents in manure water from aquaculture

摘要

目的 筛选出降臭效果好的微生物菌剂，以减少养殖泡粪水恶臭气体污染环境的问题。 方法 分别从河道底泥污水和养殖场粪污水取样, 利用平板划线分离法从2份样品中分离出菌株，进一步通过硼酸收法、锌胺络盐吸收法检测菌株的NH₃、H₂S去除率，筛选出降臭效果好的菌株并构建组合菌剂，应用于养殖泡粪水中进行除臭试验。 结果 从2份样品中分离出18株菌，有4个菌株降NH₃效果好，1个菌株均具有较好地降低NH₃和H₂S的能力，经鉴定，筛选出的5株菌B5、B6、B7、B8、B9分别为紫色色杆菌、粪产碱杆菌、肺炎克雷伯氏菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌。不同菌株组合的菌剂C（B5∶B9∶B8=1∶1∶1）对养殖泡粪水中NH₃、H₂S去除率最佳，分别是87.39%和59.57%。 结论 菌剂C对养殖泡粪水的降臭效果较好，可为高效除臭菌剂的工业化生产提供参考。

关键词

降臭微生物 / 养殖泡粪水 / 筛选 / 臭气污染 / 环保治理

Key words

microorganisms with deodorization / manure water from aquaculture / screening / odor pollution / environmental governance

近年来，在国家乡村振兴政策的支持下，养殖业由传统的个体户模式逐渐转变为规模化发展，养殖水平得到进一步提高。但是养殖业的发展产生的大量的粪污、废水，给环境带来了严重的污染问题。一般猪场清粪方式有水冲粪、水泡粪、干清粪3种，由于粪污储存处理容易，投入成本不高，耗水量少且管理成本低，不向环境直接排污且环保与农业部门认可的水泡粪清粪工艺正在被多数猪场采用。但是，泡粪水通过其中的微生物进行长时间发酵、降解，过程中散发出大量以NH₃和H₂S为主的多种成分的恶臭气体^[1]。空气中弥漫着这些恶臭气体，危害人畜健康、对环境造成严重破坏，因此，有必要对养殖泡粪水产生的恶臭气体进行降臭的研究。

目前，畜禽粪污恶臭气体的治理方法有物理、化学和微生物方法，采用物理和化学方法除臭运行成本高，技术要求高，而且容易带来二次污染，而采用微生物方法除臭，其操作简单、运行费用低、效果好，因此，微生物方法除臭已成为当前治理畜禽粪污恶臭气体的主要方式。微生物除臭法的关键是筛选出高效除臭的菌株。长期以来我国学者一直在进行除臭菌株的筛选工作^[1-2]，由于菌株来源、筛选方法及菌株的特异性等原因，筛选到的除臭菌株存在适应性差、作用单一、除臭效率低等问题。因此，筛选到适应性强、除臭效率高的菌株，并制成组合菌剂具有重要意义。

本研究从自然环境中分离、筛选出具有除臭作用的菌株，通过不同菌株的组合及除臭试验，筛选出除臭效率高的组合菌剂，初步应用于养殖泡粪水处理，旨在开发高效的除臭菌剂，减少养殖泡粪水恶臭气体污染环境的问题。

1 材料与方法

1.1 菌株样品来源

样品①，取自原灵山氮肥厂排污河道底泥污水；样品②，取自广西农职大养殖场粪污水。

1.2 降臭试验水样来源

泡粪水取自崇左市某养殖场，该养殖场采用水泡粪清粪工艺。取样后立即放入保温箱并速送回实验室保存，并尽快完成检测分析与接种。

试验时间于2024年4－5月，在广西农业职业技术大学微生物实验室进行。

1.3 主要试剂

马铃薯蔗糖培养殖基、普通琼脂培养基、高氏改良一号培养基，用于样品中真菌、细菌、放线菌增殖及分离培养；LB肉汤培养基；生化鉴定盒等试剂均由广东环凯微生物科技有限公司提供。VITEK 2 compact 微生物快速分析系统，梅里埃公司提供；麦氏比浊仪，山东霍尔德电子科技有限公司提供。

NH₃选择性培养基配方构成：氨水10.0 mL、蔗糖50.0 g、Mg SO₄·7H₂O 0.5 g、KH₂PO₄ 2.0 g、1% ZnSO₄ 5.0 mL、FeSO₄ 0.1 g、琼脂 20 g、NaCl 2.0 g、蒸馏水 1 000 mL，pH自然。

H₂S选择性培养基配方构成：K₂HPO₄ 0.5 g、葡萄糖 5.0 g、MgCl₂ 0.5 g、NH₄Cl 0.5 g、FeCl₂ 0.01 g、Na₂CO₃ 1.0 g、NaCl 0.5 g、琼脂 20.0 g、KNO₃ 1.0 g、蒸馏水 1 000 mL，pH自然。

1.4 样品菌株的分离纯化

首先将泥污水、粪污水样品，用灭菌生理盐水稀释成10^-1至10^-10不同浓度梯度，然后各取10 μL分别涂布于马铃薯蔗糖培养殖基、普通琼脂培养基、高氏改良一号培养基平板。每个样品每个浓度涂布每种平板2个，分别置于30、37 ℃培养箱培养5 d。最后将每种培养基平板上的菌落、菌苔进一步分离纯化，直到获得单个菌落为止，并将获得的单个菌株制备成斜面培养物，保存于4 ℃冰箱环境，备用。

1.5 降臭菌株的初步筛选

将分离获得的单个菌株分别进行降H₂S及降NH₃菌株的初步筛选，参照张生伟^[1]的方法进行。

1.6 高效降H₂S、NH₃菌株的复选

将以上初步筛选到的菌株接入到养殖泡粪水中进行降H₂S、NH₃能力的测定，根据结果选出能够高效降臭的菌株。

1）降H₂S能力的检测。将上述“1.5”筛选出的菌株活化，按养殖泡粪水∶活化菌液＝100∶10的比例加入，将500 mL泡粪水及相应的菌液加入至4 L的带盖塑料桶中，预先桶中放置1个50 mL无菌小烧杯，杯中装入20 mL锌胺络盐吸收液，立即用保鲜膜密封盖，放入30 ℃或37 ℃的电热恒温培养箱中培养。泡粪水加入等量的无菌超纯水作为对照组，每个处理进行3个重复。培养10 d后，采用锌胺络盐吸收比色法测定菌株接种到养殖泡粪水后H₂S的释放量。

2）降NH₃能力的检测。将上述“1.5”筛选出的菌株活化，按养殖废水∶活化菌液＝100∶10的质量比加入菌液、将500 mL泡粪水及相应的菌液加入至4 L的带盖塑料桶中，预先桶中放置一个50 mL无菌小烧杯，杯中装入20 mL 2%硼酸溶液，对照组加入等量的无菌超纯水进行同样的操作，每个处理3个重复，发酵10 d后，采用硼酸吸收凯氏定氮法测定所有菌株接种后NH₃的释放量。计算公式如下：

H₂S（或NH₃）去除率＝（对照组H₂S（或NH₃）释放量－试验组H₂S（或NH₃）平均释放量）/对照组 H₂S（或NH₃）释放量×100%。

1.7 拮抗试验

将本文“1.6”筛选出的优势菌株进行菌株间的拮抗试验，参照鲁姗^[2]的方法进行。

1.8 菌株鉴定

将本文“1.6”筛选出的高效降臭菌株分别接种于普通琼脂培养基平板、生化鉴定盒，并采用VITEK2Compact全自动微生物分析系统进行鉴定。

1.9 养殖泡粪水净化试验

将无拮抗的高效降臭菌株在LB肉汤培养基中培养24 h。取200 mL的泡粪水加入至250 mL的三角瓶中，按泡粪水体积1%的比例添加菌液，混匀，另设以无菌生理盐水作对照组，在30 ℃的电热恒温培养箱中培养2 d，记录泡粪水色泽变化。

1.10 组合菌剂的配比优化试验

1）构建组合菌剂。将筛选出的互不拮抗并且高效率除臭的菌株，采用单因素试验设计组合。首先对于NH₃和H₂S均有较高去除率的B9菌株，对NH₃的去除率最高的B5菌株固定，作为每组菌剂的固定菌株，余下的B6～B8分别搭配固定菌株。因此，形成了3个组合菌剂，具体组合如下：菌剂A（B5、B9、B6）、菌剂B（B5、B9、B7）、菌剂C（B5、B9、B8）。

2）确定组合菌剂中各菌株接种比例。按菌剂A（B5、B9、B6）、菌剂B（B5、B9、B7）、菌剂C（B5、B9、B8）中的菌株顺序，各组合菌剂中的菌株质量比均为1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2，且接种量为10%，分别接入新鲜的泡粪水中，在30 ℃电热恒温培养箱条件下培养10 d，每个给组合菌剂做3个重复，10 d后测定每个待检菌剂发酵桶中的锌胺络盐吸收液、硼酸吸收液中NH₃、H₂S的含量。

1.11 高效降臭菌的初步应用

1）组合菌剂的制备。将菌剂A（B5、B9、B6）、菌剂B（B5、B9、B7）和菌剂C（B5、B9、B8）中各菌株按1∶1∶1的质量比进行混合而成组合菌剂。

2）组合菌剂降臭能力试验。将每种组合菌剂按10%的接种量分别接种到250 mL的养殖泡粪水中，按上述“1.5”的方法，测定每组组合菌剂接种至养殖泡粪水试验中NH₃、H₂S的释放量，按公式计算出各菌剂NH₃和H₂S的去除率。

2 结果与分析

2.1 样品菌株的分离结果

本试验共分离获得18种不同的菌落，其中通过马铃薯蔗糖培养基平板获得4种菌落，分别命名为A1、A2、A3、A4；通过普通琼脂培养基获9种不同的菌落，分别命名为B1~B9；通过高氏改良一号培养基获得5种不同的菌落,分别命名为C1～C5，粪污水获得的菌株数最多，为9株，具体结果见表1。

2.2 降臭菌株的初步筛选

通过采用NH₃和H₂S选择性培养基对上述分离获得的18株菌进行接种培养，结果显示，接种H₂S选择性培养基后培养基变浑浊的菌株有B9；接种NH₃选择性培养基后培养基变浑浊的菌株有：B5、B6、B7、B8、B9；B9在H₂S选择性培养基及NH₃选择性培养基上均使培养基变浑浊，说明B9具有降NH₃和H₂S的能力。

2.3 初筛菌株的鉴定分析

将具有降NH₃和H₂S能力的菌株分别接种到相应的培养基上及相应的生化鉴定盒中进行培养,并挑取菌落进行革兰氏染色、镜检，结果见表2。

根据菌落特征、菌株的染色、镜检形态及生化试验结果，参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》^[3-4]，结合VITEK2Compact全自动微生物分析系统鉴定结果，共筛选得到5株高效降臭菌株，分别为紫色色杆菌、粪产碱杆菌、肺炎克雷伯氏菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌。

2.4 单个菌株降臭能力的对比

将保存于4 ℃的B5、B6、B7、B8、B9用LB液体培养基进行活化培养24 h，按养殖泡粪水∶活化菌液＝100∶10的比例接种至养殖泡粪水中，以未处理的新鲜1周内排出养殖泡粪水作为对照试验，在30 ℃培养箱中培养10 d后，测定碱性锌胺络盐吸收液、硼酸吸收液中NH₃、H₂S的含量,最后计算出各菌株对NH₃、H₂S的去除率，结果见表3。

由表3可以看出,筛选出的菌株对NH₃和H₂S的去臭效果有差异,其中B5、B6、B7、B8、B9均对NH₃的去除效果明显,去除率超过51.4%，去除率从高到低依次为：B5、B6、B8、B9、B7；对H₂S的去除率最高达45.14%，去除率从高到低依次为：B9、B5、B8、B6、B7。

2.5 单个菌株的拮抗试验分析

将单个菌株降臭能力检测中具有除NH₃和H₂S的菌株B5、B6、B7、B8、B9，通过普通琼脂培养基平板和滤纸片法进行菌种之间的拮抗试验，结果见表4。5种菌株间拮抗试验结果表明，所有菌株无拮抗反应。

2.6 优势菌株的养殖泡粪水净化试验

将筛选菌株B5~B9这5株菌分别加入泡粪水中，培养2 d。结果发现，投加有待检菌的处理组泡粪水色有不同程度变浅，但B7偏深，可能是B7对污水中有机物的分解能力较弱，其余菌株变化不大，B5、B6、B9、B8均可以明显提升泡粪水的透明度。

2.7 组合菌剂的最佳配比

将筛选出B5~B9这5株组合成菌剂A（B5、B9、B6）、菌剂B（B5、B9、B7）、菌剂C（B5、B9、B8），并且每个组合菌剂中3个不同的菌株以4种不同的比例接入同条件的泡粪水中培养10 d。经测定，菌剂A对NH₃去除率在65.37%~65.39%，H₂S去除率在32.74%~32.72%；菌剂B对NH₃的去除率在73.89%~73.91%，H₂S去除率在49.69%~49.71%；菌剂C对NH₃的去除率在87.38%~87.40%，H₂S去除率在59.58%~59.56%，所有组合菌剂中菌株的4种组合比例得出的测定数据差异均不显著，考虑经济成本及操作的方便性，后续试验中组合菌剂的菌株比例均采用1∶1∶1。

2.8 组合菌剂的除臭能力试验

将上述菌剂A、菌剂B和菌剂C中的单菌分别进行活化，并按上述质量配比进行混合，同时设泡粪水原液为对照组，试验组按10%的比例将组合菌剂分别加入新鲜泡粪水中，在30 ℃电热恒温培养箱条件下培养10 d，每个菌株做3个重复，再测定每个菌剂对锌胺络盐吸收液、硼酸吸收液中NH₃、H₂S的含量,最后计算出各菌剂对NH₃、H₂S的去除率。结果见表5。

由表5可知，菌剂C处理的泡粪水中NH₃平均释放量最少，菌剂B处理的泡粪水中H₂S平均释放量最少。菌剂C对NH₃、H₂S的去除率最高，分别达87.39%和59.57%。相比菌剂A、菌剂B，本研究研制的菌剂C对泡粪水中NH₃和H₂S的去除率更高。

3 讨论

3.1 菌株的分离与鉴定

本试验分离获得18个菌株，选用NH₃和H₂S选择性培养基培养进行筛选，筛选得到5株可以降解利用NH₃和H₂S的除臭菌株。查阅《伯杰细菌鉴定手册》^[3]发现，除了1株粪产碱菌属好氧菌外，其余4个菌株均属兼性厌氧菌，而且这5个单菌广泛分布于自然环境且对营养要求一般。

3.2 初筛菌株降臭效果试验

本试验筛选出的5株菌株均有降臭效果，其中有４株对氨气有较好的降解，仅有1株对硫化氢的降解效果较好。5株菌均分离自养殖粪污水，而且均是细菌类微生物，真菌及放线菌未筛选上，其原因可能是养殖粪污水取样点更适合细菌类微生物生长，富含细菌类降臭微生物所需的营养物质及磷、钾、锌、铜等元素，使该类微生物富集，而且试验中泡粪水营养成分及环境条件与分离菌株的环境相似，从而更能发挥细菌类微生物的降臭作用。

其中，命名为B5紫色色杆菌的降氨气性能最优，去除率达83.05%。目前，研究微生物菌剂降NH₃、降H₂S的报道也较多，高红梅^[5]对除臭菌进行研究，结果发现在猪粪中加入1%的除臭菌，7 d后氨气释放量及硫化氢释放量分别减少75.67%和62.32%；张卓毅等^[6]研究结果发现，猪舍连续喷洒除臭剂，平均NH₃降幅可达41.0%；单婕等^[7]研究除臭微生物对牛粪降臭的影响,结果发现处理5 d后NH₃浓度降低21.09%～78.04%；陈丽园等^[8]研究结果发现，试验除臭菌株能抑制氨气和硫化氢的释放，与对照相比，二者释放率分别降低67.95%和26.6%。但以上试验结果与本试验有不同，可能是不同菌株对NH₃及H₂S的利用能力存在差异。

3.3 组合菌剂降臭效果试验

根据单菌株降臭能力的强弱进行组合，构建组合菌剂，组合菌剂试验结果表明，菌剂C投入到泡粪水中培养10 d时，NH₃及H₂S去除率分别是87.39%、59.57%，组合菌剂综合降臭效果优于单菌株。汪英学^[9]选择地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、光合细菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌等菌种进行复合除臭，结果发现，垃圾填埋场中NH₃和H₂S浓度分别下降65.85%和87.50%；张生伟^[1]对自制的微生物菌剂进行除臭效果的研究，结果发现在第5天时对中猪粪NH₃和H₂S的去除率分别为82.14%和80.84%；王婷^[10]选择枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌单菌进行复合并进行除臭的研究，结果发现自制的除臭剂能够对垃圾渗滤液中NH₃和H₂S进行降解，降解率分别为81.6%和87.3%，与本试验研究结果相似。本研究中组合菌剂的除臭效果明显，可能是养殖泡粪水的臭气以NH₃和H₂S为主的多种成分构成，而所投加的菌剂能利用NH₃或H₂S作为自身营养需要，或各菌株间代谢产物互相利用或相互制约，最终发挥优势菌群的共同降解作用，抑制臭气的产生^[11]。

筛选出的组合菌剂具有较好的除臭能力，菌剂中各菌株可发挥不同的作用，有的使底物分解更彻底，让其余菌株更好地利用中间产物作为营养物质，或减小中间产物对后续反应的抑制；有的生长代谢产物可为其余菌株提供营养，进而促进利用臭气成分作为营养物质的菌株生长，起到间接除臭的作用。

4 结论

本研究从和河道底泥污水和畜禽排出粪污水环境中采样，分离获得18株菌，通过NH₃和H₂S选择性培养基进行初筛，获得5株可以降解利用NH₃、H₂S的除臭菌株，进一步鉴定发现5株菌分别为紫色杆菌、粪产碱杆菌、肺炎克雷伯氏菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌。

通过单菌除臭检测，筛选出1株命名为B5的菌株，对NH₃的去除率最高，可达83.05%；筛选出1株命名为B9菌株，对H₂S的去除率也较高，可达45.14%。B5经初步鉴定为紫色色杆菌，B9经初鉴定为蜡状芽孢杆菌。采用筛选出的5株菌处理养殖泡粪水，结果发现5种菌株均能改变污水色泽，使透明度增加；B5、B6、B9、B8菌株的净化效果最明显，具有很好的应用前景。根据5株单菌的除臭效果及种类，构建了3种组合菌剂，分别命名为菌剂A、菌剂B、菌剂C，通过组合菌剂中的单菌之间的相互协同作用，共同抑制臭气的产生或共同降解臭气而达到降臭的效果。本试验结果显示，菌剂C对养殖泡粪水的除臭效果最好，对养殖泡粪水中NH₃、H₂S的去除率均较其他处理组高，分别是87.39%和59.57%。

综上，本试验所选的菌株均属自然界中常见菌，菌种安全，对污水有一定降解效果，通过组合菌剂中菌株及泡粪水中菌群间共同作用，降臭效果比较好，为养殖泡粪水高效除臭菌剂的工业化生产提供了参考。

参考文献

[1] 张生伟. 猪粪高效除臭菌株筛选及其除臭机理研究[D]. 兰州： 甘肃农业大学, 2016.

[2] 鲁姗. 处理农村生活污水的复合菌剂构建及发酵条件的优化[D]. 呼和浩特： 内蒙古农业大学， 2019.

[3] 布坎南R E.吉本斯N E. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 第八版.北京: 科学出版社, 1984：643-650．

[4] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 2001。

[5] 高红梅. 猪粪堆肥高效除臭菌群发酵条件优化及参数筛选[D]. 合肥: 安徽农业大学, 2011．

[6] 张卓毅, 吴迪梅, 张丽丽, 微生物除臭剂的筛选及在猪舍的应用试验[J]. 北京农业, 2014(6):2-5.

[7] 单婕, 邵孝侯. 有效微生物与调理剂在奶牛粪堆肥中的保氮与除臭效应[J]. 安徽农业科学, 2008,36(2)：646-648.

[8] 陈丽园, 吴东, 夏伦志, 畜禽粪便除臭微生物的分离与筛选[J]. 畜牧与兽医, 2008,40(12):59-61.

[9] 汪英学. 复合微生物制剂处理垃圾恶臭气体的研究[D]. 武汉： 华中农业大学, 2012.

[10] 王婷. 厨垃圾处理及除臭微生物菌剂的制备和应用[D]. 北京： 北京化工大学, 2018.

[11] 余海晨, 张清敏, 侯树宇, 高效除臭菌的筛选及其降解特性研究[J]. 农业环境科学学报, 2004,23(2):300-303.

基金资助

2023年广西农业职业技术大学科研项目(XKJ2328)