高原地区鸡精液冷冻保存技术研究

朱新培; 高玉琼; 赵家才; 毛翔光

doi:10.13300/j.cnki.cn42-1648/s.2025.01.002

养殖与饲料 ›› 2025, Vol. 24 ›› Issue (01) : 5 -8. DOI: 10.13300/j.cnki.cn42-1648/s.2025.01.002

遗传育种

高原地区鸡精液冷冻保存技术研究

朱新培 ¹^,² ,
高玉琼 ¹^,² ,
赵家才 ¹^,² ,
毛翔光 ¹^,²^,^*

作者信息 +

Cryopreservation techniques of chicken semen in plateau regions

Xinpei ZHU ¹^,² ,
Yuqiong GAO ¹^,² ,
Jiacai ZHAO ¹^,² ,
Xiangguang MAO ¹^,²^,^*

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摘要

[目的]为解决云南高原地区鸡精液冷冻保存质量差的问题，优化鸡精液冷冻保存的技术流程。[方法]选用茶花二号和云岭红种公鸡精液为研究对象，对比分析了不同成分的精液稀释液、不同比例的抗冻剂及冷冻方法的保存效果，使用计算机辅助精子分析系统、姬姆萨染色法和伊红染色法检测鸡精液的冻后活力、顶体完整率、畸形率。[结果]基础液配方2液、3液和7液效果较好；GL+10%卵黄和DMSO+20%卵黄的冻精活力显著优于DMA+20%卵黄、EG+15%卵黄，分别为34.1%、31.6%、27.4%、19.9%，精子顶体完整率差异不显著；应用程控仪和大口罐冷冻其精液的冻后活力、顶体完整率、畸形率差异不显著。[结论]应用程控仪采用添加葡萄糖、乳糖及柠檬酸钠为基础液，添加防冻剂EG+15%卵黄和DMSO+20%卵黄制作冷冻精液为佳

关键词

鸡 / 按摩法采精 / 细管 / 精液品质 / 冷冻精液 / 高原地区

Key words

chicken / collecting semen with massage / fine tubes / quality of semen / frozen semen / plateau regions

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朱新培,高玉琼,赵家才,毛翔光. 高原地区鸡精液冷冻保存技术研究[J]. 养殖与饲料, 2025, 24(01): 5-8 DOI:10.13300/j.cnki.cn42-1648/s.2025.01.002

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鸡精液冷冻保存，能有效降低鸡种质资源灭绝风险，减少疾病传播及提升优秀种源的商业价值，具有重要意义。自1941年鸡精子冷冻输精获得成功开始，国内外诸多学者对冷冻程序（基础稀释液、冷冻保护剂、冷冻速率、解冻环节等）一系列关键操作技术展开相关研究^[1-4]。近年来，鸡精液冷冻保存技术虽然获得了较好的进展，但因鸡冷冻精液的受精率均低于新鲜精液，且其重复性难以得到有效复制，冷冻精液在鸡生产中还未能较大规模推广利用。目前针对云南高原地区鸡精液冷冻保存的研究较少。笔者所在团队于2021年起开展一系列云南鸡精液的冷冻保存试验，对比分析了采用不同成分的精液稀释液、不同比例的抗冻剂及不同冷冻方法后鸡精液的冻后活力、顶体完整率、畸形率，建立并优化鸡精液冷冻保存的技术流程，以期实现云南高原地区鸡冷冻精液技术的应用及推广。

1 材料和方法

1.1 试验动物

供试验鸡精液来源于云岭广大有限公司养殖基地的25~30周龄茶花二号和云岭红种公鸡各10只。种公鸡健康无病，符合采精和试验要求。

1.2 仪器设备和试剂

卡苏精子密度测定仪(4-164)，卡苏细管分装机（DISTRIBUTEURISEVO），分光光度计（ACCUCELL），程控冷冻仪(Digicool5300)，CEROS Π计算机辅助精子分析系统，相差显微镜，恒温水浴锅，电子天平，热电偶，电冰箱、大口径液氮罐，干燥箱；果糖，葡萄糖，蔗糖，乳糖，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，柠檬酸钠，柠檬酸，谷氨酸钠，三羟甲基胺基甲烷，EDTA（二钠），无水醋酸钾，聚乙烯吡咯烷酮，硫酸鱼精蛋白，双蒸水，姬姆萨染液，伊红染液，甘油(GL)，二甲基亚砜丙二醇(DMSO)，二甲基乙酰胺(DMA)，乙二醇(EG)。

1.3 种公鸡的饲养方式

种公鸡饲养方式为全封闭式饲养和全进全出制，舍内保持干燥，通风良好，按营养需要供给全价日粮，供给清洁饮水，保持良好的生理状态和种用体况。

1.4 生物安全措施

人员、车辆、物品等，更衣消毒后方能进入，生产区定期消毒，严格门卫制度，疫区人员、车辆、物品严禁进入生产区。

1.5 种公鸡的采精

试验种公鸡采用按摩法采精，同一品种不同个体的精液混合在一起，鸡精液采集达到试验需要的数量，避光、保温、防尘、防辐射，快速送到实验室。检测原精液品质，原精活力达到60%以上的精液用稀释液稀释，用于后续试验研究。

1.6 鸡冷冻精液的制作流程

1）鸡精液的稀释、平衡、分装标记和冷冻。经检验，原精活力达60%以上，且无其他异常符合冷冻制作的的原精确定冷冻稀释液的需要量，按试验要求分为数等分，用不同配方的冷冻稀释液采用一步稀释法逐一稀释，检查记录稀释后精子活力，用细管分装机分装、封口和标记，整齐地码放在细管架上，放入4 ℃的冰箱内平衡2~4 h，平衡后的精液在-150~-130 ℃下冷冻，冷源为液氮，精液离液氮面3~6 cm熏蒸冷冻，冷冻时间10~13 min或用程控仪进行冷冻。

2）鸡精液的解冻、包装和冷冻精液质量检查。鸡细管精液冷冻完成后，取出放入液氮中，随机抽样解冻，冷冻精液解冻温度38 ℃，解冻时间10 s，在载物台温度为37 ℃下检查解冻后鸡精子活力、顶体完整率、畸形率^[2]，解冻活力30%以上的鸡冷冻精液装入拇指管，每管25支，用纱布袋包装拇指管，入库保存和后续试验。

1.7 试验设计

试验分2个阶段进行，先拟定8个稀释液配方进行单因素试验，不同成分的鸡精液基础液配方见表1。再筛选效果良好的3个稀释液作为基础液，选择4种防冻剂：甘油（Glycerine，GL）、二甲基乙酰胺(dimethylacetamide，DMA）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO)和乙二醇(ethyleneglycol，EG），以及3个水平的卵黄，进行组合试验（表2）。

1.8 数据来源与处理

数据来源于鸡精液检测记录，采用SPSS 19.0软件进行处理，结果以“平均值±标准差”表示，用生物统计法对数据进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同成分的鸡精液稀释液基础液的效果对比

8个稀释液配方鸡原精液活力及冷冻精液品质的结果见表3。由表3可见，鸡精液不同配方基础液稀释液中，原精活力差异不显著。2液、3液和7液鸡冷冻精液解冻后活力显著高于其他基础液配方；2液、6液、7液和8液鸡冷冻精液解冻后顶体完整率均显著高于5液、1液和4液。综合来看，2液、3液、7液作为基础液配方制备的鸡冷冻精液品质较好，冻精活力接近40%，畸形率不超过12%，分别编号为A₁液、A₂液和A₃液，再进行验证试验（表4）。2.2　不同比例的鸡精液稀释液防冻剂的效果对比

以GL为防冻剂，添加量4%，基础液2液，卵黄10%为组合1；以DMA为防冻剂，添加量8%，基础液2液，卵黄20%为组合2；以DMSO为防冻剂，添加量10%，基础液3液，卵黄20%为组合3；以EG为防冻剂，添加量5%，基础液2液，卵黄15%为组合4，进行不同比例的防冻剂对比试验，结果见表5。

由表5可见，GL+10%卵黄的防冻效果最好，但与DMSO+20%卵黄的差异不明显；以GL+10%卵黄为防冻剂，精子解冻后活力最高，但畸形率显著高于EG+20%卵黄、DMSO+20%卵黄，与DMA+20%卵黄的差异不显著；以GL+10%卵黄和DMSO+20%卵黄为防冻剂，精子解冻后活力最好，但DMA+20%卵黄和EG+15%卵黄在本试验中抗冻效果不佳。

2.3 不同冷冻方法制备的鸡冷冻精液的效果对比

不同冷冻方法制备的鸡冻精解冻后的精液品质效果见表6。由表6可见，大口罐冷冻法和程控仪冷冻法制备的鸡精液，解冻后活力、顶体完整率和畸形率之间的差异均不显著。

3 讨论

精液稀释剂在精子细胞特性的保存中起着至关重要的作用，包括精子活力、运动性、顶体完整性和线粒体膜电位。Thananurak等^[5]研究发现TNC稀释剂适合作为泰国本地鸡精液合适且有用的冷冻保存介质，在冷冻和解冻过程后能保持公鸡精液的质量和受精率。本研究结果表明，不同配方基础液间鸡精液品质具有差别。8个基础液鸡冷冻精液解冻后畸形率差异不明显，2液、6液和7液鸡冷冻精液解冻后畸形率较低。基础液配方影响鸡冷冻精液质量，2液、3液和7液效果良好。

使用不同防冻剂对鸡冷冻精液解冻后的品质差异明显。王世银^[6]研究结果表明，鸡精液冷冻时的最佳抗冻剂为6%的甘油,其次为6%的DMSO,最后10%的DMA和4%的乙二醇。联合抗冻剂冷冻效果与单一抗冻剂差异不显著。陈世伟等^[2]研究发现添加抗冻剂组合8%甘油+6%DMSO的稀释精液在平衡30 min时,精液解冻后精子活力最高，复苏率最高，存活时间较长。刘启红等^[7]对比了DMA、甘油与DMF为保护剂的鸡精液冷冻技术体系，认为甘油细管是目前鸡精液冷冻保存建设的首选方案。与上述研究结果一致，本研究结果发现，GL+10%卵黄和DMSO+20%卵黄的冻精活力相对较高。但与本研究结果不同，何孟纤等^[8]研究发现，在鸡精液冷冻过程中,添加全卵黄成分不利于其冷冻保存；10%的卵黄上清可显著提高鸡精子的抗冻能力。分析原因是由于研究使用的鸡精液均为混合精液，未考虑个体对精液质量的影响，基础液和防冻剂是影响鸡冷冻精液质量的决定因素。不同防冻剂的用量和与不同基础液的优化组合仍需进行深入研究。

不同冷冻方法制备鸡冷冻精液品质无差异。程控仪冷冻法冷冻鸡精液更方便操作、可控性较强，因此程控仪冷冻法优于大口罐冷冻法冷冻鸡精液。本研究结果表明，高原地区鸡精液制作冷冻保存技术，可以提高优良鸡种的利用率，为地方品种保护提供有效措施，有利于良种提升。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

[1]	周乐乐, 李承德, 黄建豪, 等, 鸡精液稀释配方对低温保存精子活力和输精效果的影响 [J]. 中国畜牧兽医, 2020,47(6):1837-1843.

[2]	陈世伟, 张兆旺, 孟锦涛. 抗冻剂组合和平衡时间与鸡精液冻后活力关系的研究[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2021(9):73-77.

[3]	袁静, 赵成莹, 王素红. 鸡精液保存技术[J]. 畜牧兽医科学(电子版), 2021(4):130-131.

[4]	刘子秋. 以DMA、DMF 与甘油为保护剂的鸡精液冷冻技术适用性研究[D]. 长沙：湖南农业大学， 2021.

[5]	THANANURAK P, CHUAYCHU-NOO N, PHASUK Y, et al. Comparison of TNC and standard extender on post-thaw quality and in vivo fertility of Thai native chicken sperm[J]. Cryobiology, 2020，92:197-202.