黑龙江齐齐哈尔地区牛呼吸道疾病综合征重要病原体流行病学调查

Epidemiological investigation of important pathogens of bovine respiratory disease syndrome in Qiqihar, Heilongjiang Province

摘要

[目的]了解黑龙江省齐齐哈尔地区牛呼吸道疾病综合征重要病原体流行与病原菌的耐药情况，为齐齐哈尔地区牛呼吸道疾病综合征的防治提供依据。[方法]采集齐齐哈尔不同地区规模化养殖场及散养户发病牛的鼻拭子样本594份，应用PCR检测样本中携带的牛呼吸道疾病综合征病原体，并进行细菌分离培养及药敏试验。[结果]594份鼻拭子样品中共有209份样品携带牛呼吸道疾病综合征病原体，其中牛支原体检出率为33.01%、多杀性巴氏杆菌检出率为15.79%、溶血性曼氏杆菌检出率为16.75%、牛传染性鼻气管炎病毒检出率为15.79%、牛病毒性腹泻病毒检出率为20.57%。通过细菌分离培养获得多杀性巴氏杆菌27株、溶血性曼氏杆菌26株。通过药敏试验发现多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌三重耐药菌株占比分别为51.85%和38.46%，四重耐药菌株占比分别为22.22%和23.08%，五重耐药菌株占比分别为22.22%和15.38%，六重耐药菌株占比分别为3.70%和23.08%。[结论]黑龙江省齐齐哈尔地区引起牛呼吸道疾病综合征的重要病原体检出率较高，多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌菌株多重耐药情况较为严重。

关键词

牛呼吸道疾病综合征 / 病原体 / 细菌分离鉴定 / PCR检测 / 药敏试验

Key words

bovine respiratory disease syndrome / pathogens / isolation and identification of bacteria / PCR detection / drug sensitivity test

牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease complex，BRDC），是由多种病原体、外部环境因素、动物身体状况相互影响引起的一种牛呼吸系统疾病^[1]。牛呼吸道疾综合征常见的病原体包括牛支原体（Mycoplasma bovis）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinortracheitis virus）和牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus）等^[2]。随着规模化、集约化养殖模式和“北牛南养”的育肥方式逐渐增多，牛呼吸系统综合征发病率逐渐上升。6周龄左右的牛为BRDC的易感牛群，牛在患病后会出现咳嗽、支气管炎症和发热等症状。在发病后期，患病牛不仅会出现呼吸系统疾病，也会因采食量下降而体态消瘦。因BRDC死亡的牛经过解剖后会发现，其肺部有纤维化病灶、肺部肿大和肺部积液等^[3]。

为了解黑龙江省齐齐哈尔市地区牛BRDC病原体的流行病学情况，本试验采集齐齐哈尔地区规模化养殖场及散养户发病牛的鼻拭子样本，通过PCR检测样本中携带的BRDC病原体，并对细菌病原体进行分离培养及药敏试验，为齐齐哈尔地区牛BRDC的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛支原体、溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒阳性病料，均由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院保存。HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、2×Taq Plus Master Mix Ⅱ，均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。DNA、RND提取试剂盒，均购自天根生物科技有限公司。试验所用PCR引物，均由库美生物科技有限公司合成。

1.2 模版DNA/cDNA的提取

采集齐齐哈尔周边地区出现呼吸系统疾病的牛鼻拭子样品，共获得鼻拭子样品594份。将鼻拭子样品与PBS混合均匀，将混匀后的样品反复冻融数次后离心，取上清进行DNA和RNA提取。将提取的RNA经过HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit处理后获得cDNA。

1.3 引物合成及运行程序

根据孙凌炜^[1]和石柯^[4]的研究，针对牛支原体的uvrC基因、溶血性曼氏杆菌的gc基因、多杀性巴氏杆菌的kmt基因、牛传染性鼻气管炎病毒的gE基因和牛病毒性腹泻病毒的5'-UTR基因设计特异性引物，引物序列如表1所示。PCR扩增程序如表2所示。将提取的样本DNA和cDNA进行PCR检测。

1.4 药敏试验

将多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌PCR检测阳性的样本进行细菌分离培养，将鼻拭子接种到绵羊血琼脂培养基上，分别将光滑、湿润、边缘整齐、不溶血的淡灰白色的水滴样小菌落和产β溶血的菌落进行分离培养。培养完成后，进行革兰氏染色、瑞氏染色和美兰染色。将初步判断为多杀性巴氏杆菌和曼氏溶血杆菌的菌株进行纯培养，提取DNA，进行细菌通用引物的PCR检测，将PCR产物进行测序，测序结果与数据库中细菌已知序列对比。将已经确定为多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的菌株根据2023年美国临床和实验室标准协会（CLSI）-33版执行标准进行药敏试验，CLSI-33版执行标准进行菌株药物敏感性判读，判读结果分为耐药、中介和敏感。

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果

由PCR检测结果（图1）可知，在594份鼻拭子样品中，共有209份样品为PCR检测阳性。其中，牛支原体检出率为33.01%（69/209）、多杀性巴氏杆菌检出率为15.79%（33/209）、溶血性曼氏杆菌检出率为16.75%（35/209）、牛传染性鼻气管炎病毒检出率为15.79%（33/209）、牛病毒性腹泻病毒检出率为20.57%（43/209）。牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒混合感染1例，牛支原体和牛病毒性腹泻病毒混合感染1例。

2.2 细菌分离培养结果

将多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌阳性的鼻拭子样品接种到5%羊血琼脂培养基上进行分离培养及纯化。通过观察菌落形态、染色、细菌通用引物的PCR产物测序，共分离出27株多杀性巴氏杆菌、26株溶血性曼氏杆菌，分离率分别为81.82%、74.29%（表3）。

2.3 药敏试验结果

多杀性巴氏杆菌分离株药敏结果如表4所示。巴氏杆菌分离株对β-内酰胺类药物头孢噻肟、氨苄西林和头孢哌酮的耐药率在22.22%~29.63%；喹诺酮类药物左氧氟沙星、环丙沙星的耐药率为55.56%；氨基糖苷类药物链霉素、庆大霉素和阿米卡星的耐药率为48.15%~70.37%；四环素类药物四环素、多西环素的耐药率为51.86%~55.56%；多肽类药物多粘菌素的耐药率为51.86%；磺胺类药物复方新诺明的耐药率为62.96%。

溶血性曼氏杆菌分离株药敏结果如表5所示。溶血性曼氏杆菌分离株对β-内酰胺类药物头孢噻肟、氨苄西林和头孢哌酮的耐药率为50.00%~61.54%；喹诺酮类药物左氧氟沙星、环丙沙星的耐药率为38.46%~46.15%；氨基糖苷类药物链霉素、庆大霉素和阿米卡星的耐药率为42.31%~65.38%；四环素类药物四环素、多西环素的耐药率为55.56%~57.69%；多肽类药物多粘菌素的耐药率为53.85%；磺胺类药物复方新诺明的耐药率为57.69%。

分离出的多杀性巴氏杆菌分离株和溶血性曼氏杆菌分离株多重耐药情况如图2所示。多杀性巴氏杆菌分离株中，三重耐药菌株占比率为51.85%、四重为22.22%、五重为22.22%、六重为3.70%；溶血性曼氏杆菌分离株中，三重耐药菌株占比率为38.46%、四重为23.08%、五重为15.38%、六重为23.08%。

3 讨论

多种可引起牛呼吸道疾病综合征的病原体与应激因素相互作用于牛，导致牛发病。牛呼吸道疾病综合征的病原体包括细菌、病毒和支原体^[5]。病毒主要包括牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒等；细菌主要包括溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和睡眠嗜血杆菌等；支原体主要包括牛支原体、牛鼻支原体和殊异支原体等^[6]。BRDC的主要临床表现为呼吸急促、咳嗽、发热、采食量和产奶量下降等^[7]。易鹏飞等^[8]对南疆地区安格斯牛繁育场犊牛BRDC病毒病原进行调查，发现南疆地区犊牛BRDC病毒病原体以牛传染性鼻气管炎病毒感染为主，并伴有与牛病毒性腹泻病毒混合感染，主要在春、夏两季发病率升高。王方国^[9]对青藏部分地区牦牛BRDC病原进行检测与分析，发现牛支原体检出率为20.12%、多杀性巴氏杆菌检出率为16.80%、溶血性曼氏杆菌检出率为14.16%。Guo等^[10]评估内蒙古地区患有BRDC的肉牛病毒感染情况，发现牛病毒性腹泻病毒、牛疱疹病毒1型、牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞病毒的感染率分别为44.70%、24.83%、5.63%和6.95%。随着规模化养殖和异地育肥模式的增多，BRDC发病率也逐渐增多。

本试验中，牛支原体的检出率最高，为33.01%，高于刘镜等^[11]在贵州地区检测值24.90%，高于张淮瑜^[12]在宁夏部分地区检测值24.60%，低于Niu等^[13]在青海地区检测值48.70%，低于冷婧^[14]在南疆地区集约化牛场检测值39.02%，与Pardon等^[15]在比利时检测值33.30%相近。牛支原体的检出率呈现出逐渐增加的趋势^[16]。本研究中，牛病毒性腹泻病毒的检出率为20.57%，高于魏硕佟^[17]在宁夏地区检测值8.06%，高于董坤^[18]在吉林地区检测值12.22%，低于Mahmoud等^[19]在埃及南部地区检测值34.78%，低于Zhigailov等^[20]在哈萨克斯坦检测值48.60%。本研究中，溶血性曼氏杆菌的检出率为16.75%，略高于王方国^[9]在青藏部分地区牦牛中检测值14.16%，高于杨依波^[21]在临沧市检测值2.50%。本研究中，多杀性巴氏杆菌检出率为15.79%，低于杨依波^[21]检测值21.56%，低于张正刚^[22]在宁夏地区检测值20.2%，低于Abdulkadir等^[23]在埃塞俄比亚东部地区检测值23.17%。牛传染性鼻气管炎病毒检出率为15.79%，低于任强林^[24]在新疆地区检测值27.06%，高于鲍显伟等^[25]在宁夏地区检测值14.13%。本研究中，从PCR阳性样本中分离出多杀性巴氏杆菌菌株的分离率为81.82%，高于朱杰等^[26]检测的52.17%，高于杨依波^[21]检测的53.07%，高于Sellyei等^[27]检测的65.57%；从PCR阳性样本中分离出溶血性曼氏杆菌菌株的分离率为74.29%，高于朱杰等^[26]检测的61.11%，高于贾开文等^[28]检测的57.14%，表明本研究中多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌分离率较好。了解BRDC病原体的流行情况，对于BRDC的防治具有非常重要的经济和临床意义。

随着抗生素的使用，细菌的耐药问题愈发严重^[29]。本试验中分离出的多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌菌株多重耐药问题较为严重，部分菌株均达到六重耐药。分离出的多杀性巴氏杆菌对喹诺酮类药物和链霉素的耐药性较为严重，溶血性曼氏杆菌菌株对氨基糖苷类和四环素类药物耐药较为严重。这可能与齐齐哈尔地区多年的用药习惯有关。对细菌耐药的检测，可有效了解细菌的抗菌谱，为细菌疾病的防治提供依据。

本研究发现，齐齐哈尔地区牛支原体、牛病毒性腹泻病毒检出率较高，多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的耐药情况较为严重，需要根据实际情况合理制定BRDC防治措施。

参考文献

[1] 孙凌炜. 中国北方部分地区牛呼吸道综合征主要病原流行病学调查[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2022.

[2] WERID G M, MILLER D, HEMMATZADEH F, et al. An overview of the detection of bovine respiratory disease complex pathogens using immunohistochemistry: emerging trends and opportunities[J]. Journal of veterinary diagnostic investigation, 2024, 36(1): 12-23.

[3] 马成松. 牛呼吸道疾病综合征的防治[J]. 畜禽业, 2023,34(9):87-89.

[4] 石柯. 牛呼吸道疾病综合征病原多重PCR检测方法建立及应用[D]. 贵阳: 贵州大学, 2022.

[5] ZHOU Y, SHAO Z, DAI G, et al. Pathogenic infection characteristics and risk factors for bovine respiratory disease complex based on the detection of lung pathogens in dead cattle in northeast China[J]. Journal of dairy science, 2023, 106(1): 589-606.

[6] BELL R L, TURKINGTON H L, COSBY S L. The bacterial and viral agents of BRDC: immune evasion and vaccine developments[J]. Vaccines, 2021, 9(4): 337-351.

[7] FERRARO S, FECTEAU G, DUBUC J, et al. Scoping review on clinical definition of bovine respiratory disease complex and related clinical signs in dairy cows[J]. Journal of dairy science, 2021, 104(6): 7095-7108.

[8] 易鹏飞， 马雪连， 孙亚伟， 新疆南疆安格斯牛繁育场犊牛呼吸道病毒病病原调查[J]. 中国兽医学报， 2023，43(1)：72-78.

[9] 王方国. 青藏部分地区牦牛BRDC细菌病原分子检测与分析[D]. 成都： 四川农业大学， 2022.

[10] GUO T, ZHANG J, CHEN X, et al. Investigation of viral pathogens in cattle with bovine respiratory disease complex in Inner Mongolia, China[J]. Microbial pathogenesis, 2021, 153(2): 104594-104601.

[11] 刘镜， 姜玲玲， 杨莉， 贵州地区肉牛BRDC的4种病原调查与分析[J]. 黑龙江畜牧兽医， 2021，12(1)：69-73.

[12] 张淮瑜. 宁夏部分地区牛主要呼吸道传染病流行病学调查[D]. 银川: 宁夏大学， 2022.

[13] NIU J, LI K, PAN H, et al. Epidemiological survey of Mycoplasma bovis in yaks on the qinghai tibetan plateau, China[J]. BioMed research international, 2021, 14(1):6646664-6646681.

[14] 冷婧. 新疆南疆集约化牛场牛支原体病流行病学调查、病原分离鉴定及耐药基因检测[D]. 阿拉尔： 塔里木大学， 2024.

[15] PARDON B, CALLENS J, MARIS J, et al. Pathogen-specific risk factors in acute outbreaks of respiratory disease in calves[J]. Journal of dairy science， 2020，3(3)：2556-2566.

[16] 郭亚男. 宁夏地区牛支原体分型鉴定及其对牛外周血单核巨噬细胞的功能影响研究[D]. 银川： 宁夏大学， 2020.

[17] 魏硕佟. 牛呼吸道综合征多重PCR检测方法的建立及牛呼吸道合胞体病毒的分离鉴定[D]. 银川： 宁夏大学， 2022.

[18] 董坤. 牛病毒性腹泻的流行病学调查与牛场的净化[D]. 长春： 吉林大学， 2023.

[19] MAHMOUD H, ALI A. Epidemiological investigation on bovine alphaherpesvirus 1 and bovine viral diarrhea virus in cattle and camels in southern egypt[J]. Veterinaria italiana, 2022, 58(4): 31-49.

[20] ZHIGAILOV A V, PERFILYEVA Y V, OSTAPCHUK Y O, et al. Molecular and serological survey of bovine viral diarrhea virus infection in cattle in Kazakhstan[J]. Research in veterinary science， 2023，162(1)：104965-104979.

[21] 杨依波. 临沧市牛呼吸道综合征细菌性病原的分离与鉴定[D]. 昆明： 云南农业大学， 2023.

[22] 张正刚. 牛羊多杀性巴氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D]. 银川： 宁夏大学， 2024.

[23] ABDULKADIR M， NIGUSSIE T， KEBEDE IA. Isolation and identification of Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica from pneumonic small ruminants and their antibiotic susceptibility in haramaya district, eastern Ethiopia[J]. Scientific world journal， 2024，16(1)：5605552-560578.

[24] 任强林. 牛传染性鼻气管炎病毒TaqMan-gB荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 乌鲁木齐： 新疆农业大学， 2022.

[25] 鲍显伟， 李昊， 李小龙， BVDV、IBRV和AKAV多重PCR检测方法的建立与应用[J]. 中国兽医学报， 2024，44(1)：39-43.

[26] 朱杰， 赵旭， 东笑， 牛多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及致病力评估[J]. 中国兽医学报， 2024，44(1)：80-87.

[27] SELLYEI B, RONAI Z, JANOS S, et al. Comparative analysis of Pasteurella multocida strains isolated from bovine respiratory infections[J]. Acta Microbiol Immunol Hung， 2015，62(4)：453-461.

[28] 贾开文， 操义恒， 王子杰， 新疆牛源溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性和毒力分析[J]. 中国预防兽医学报， 2023，45(2)：201-206.

[29] ZHANG J, LI M, XU R, et al. Electrokinetics in antimicrobial resistance analysis: A review[J]. Electrophoresis, 2023, 44(2): 323-336.