一起由应激引发牛支原体与巴氏杆菌混合感染的诊治

摘要

2023年4月，云南省普洱市某肉牛养殖场部分牛先后出现精神沉郁、食欲减退、呼吸困难、流涎、体温升高等症状，并陆续出现死亡的情况。为查明病因，开展现场调查并采集症状明显的病牛口鼻棉拭子、全血和病死牛组织样品，通过临床检查、病理剖检、实验室检测等方法进行诊断。结果显示，病死牛肺脏出血、肉样变、伴有肺气肿，肝叶质地变脆，肾脏淤血、肾乳头肿胀，心包积液、脂肪变性，睾丸肿大等。采用荧光定量PCR方法对患病牛口鼻棉拭子及病死牛组织进行多杀性巴氏杆菌和牛支原体核酸检测发现，多杀性巴氏杆菌和牛支原体核酸检测为阳性。通过采取对因、对症治疗，严格消杀等综合性防控措施，该牛场病情得以控制并逐步恢复正常生产。

关键词

牛 / 支原体 / 多杀性巴氏杆菌 / 诊断 / 治疗

近年来，由于肉牛养殖业发展力度不断加大，肉牛调运逐渐增多，部分起运地至目的地距离较远，饲养环境也大不相同，导致牛在到达目的地之后都会发生不同程度应激反应，从而促发牛呼吸系统疾病综合征。牛呼吸系统疾病综合征（bovine respiratory disease complex,BRDC）是由多种病原引起的呼吸系统疾病总称，临床表现常以呼吸系统症状为主的传染性疾病，如咳嗽、流鼻涕、食欲减退和呼吸困难等，可同时侵害不同年龄阶段的牛，具有较高的发病率和死亡率，是国内外严重危害养牛业健康发展的重要疾病之一^[1-2]。BRDC的病原主要有支原体、曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、疱疹病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞体病毒、冠状病毒等，这些病原体会损害牛呼吸道上皮细胞，引起肺炎、支气管炎，而且可以抑制免疫系统，造成继发感染，导致病情恶化，甚至死亡^[3]。有研究表明，部分流感病毒也有可能导致牛呼吸系统疾病综合征^[3]。临床上，BRDC病因复杂，引起的症状也极为相似，仅根据临床症状很难判定病原，必须配合实验室检测^[4]。支原体是我国牛呼吸系统疾病综合征的主要病原^[5-6]。

2023年4月，普洱市某肉牛养殖场先后从外地购入西门塔尔杂交牛69头，该场牛舍由原农副产品收储仓库改造而成，牛棚低矮，棚顶为彩钢瓦，舍内温度较高且通风不良，经过长途运输到达后立即进行口蹄疫疫苗免疫。不久后，牛只出现精神萎靡、食欲不振、反刍停止、呼吸困难、流涎、体温升高等症状，并陆续出现死亡的情况。为明确病因，为该场提供有效的预防控制措施，通过现场调查、临床分析、病理剖检、实验室检测等方法进行诊断，旨在为肉牛养殖及从事相关工作人员提供参考。

1 发病情况

2023年4月19日，该牛场从外地购入第1批育肥牛17头，4月20—24日购入41头，28日购入6头，4月29日购入5头，共计购入69头。该批牛均为西门塔尔杂交公牛，平均体质量650 kg，购入后全群隔离饲养，并在入场当天及第2天接种口蹄疫O型-A型二价灭活疫苗。

第1批牛购入6 d后，有7头牛不同程度发病，4月26日发病牛增至25头，30日增至67头。2023年5月7日，1头病牛死亡，病程7 d，后陆续出现死亡，病程7~30 d，共计死亡13头。该牛场饲养环境较差，4月起该牛场所在地区出现高温酷暑天气，室外温度在37 ℃以上，牛舍温度不低于33 ℃，牛舍为半开放式，通风散热差，该场管理人员采用洒水降温，但降温效果不理想。

2 临床检查及病理剖检

2.1 临床检查

病牛精神沉郁，轻者食欲减退，重者采食和反刍停止，体温升高至41~42 ℃，反复高温；少量牛出现低温32 ℃、胀气；眼球凸起、充血；初期眼睛流泪、闭口流涎呈泡沫状、流鼻液、鼻头红肿，濒死病牛呈腹式呼吸、呼吸急促、呼吸频率达60~80次/min；眼球发绀、呼吸衰竭、关节肿胀、后肢无力、卧地不起，有的肛门流出黄色黏液，带血液。病程达15 d以上的牛部分出现胸部、头颈部水肿，呼吸困难，高烧40 ℃（图1、图2）。

2.2 剖检病变

对已死亡的1头病牛和濒临死亡的1头病牛进行剖检，发现2头病牛皮下有胶冻样渗出，颌下淋巴质地发硬，胸腔积液，肺脏出血、肉样变、伴有肺气肿、质地松软，肝叶质地变脆，肾脏局部有淤血、肾乳头突起稍有肿胀，心包积液、心肌有不同程度的脂肪变性，睾丸肿大（图3~图5）。

2.3 采集病料

无菌采集病死牛肝、脾、肺、肾组织各约20 g于5号自封袋中，记号笔分别标注；采集发病牛口鼻腔深部棉拭子，置于5 mL离心管中，加PBS保存。

3 实验室检测及诊断

3.1 病毒核酸提取

剪取病死牛肝、脾、肺、肾组织4种病料适量，放入2 mL离心管中，加钢珠1粒，加生理盐水1 mL，组织研磨仪（北京鼎昊源，TL2020）处理，高速离心机（德国Eppendorf AG，5804R）10 000 r/min离心1 min，取上清液移入1.5 mL离心管备用；取1 mL口鼻棉拭子培养液10 000 r/min离心1 min，取上清检测。使用西安天隆病毒DNA/RNA提取试剂盒（4.0）提取病毒核酸，待检。

3.2 细菌、支原体核酸提取

超声波充分破碎组织，加入适量生理盐水，充分振荡混匀，1 000 r/min离心2 min，取上清，10 000 r/min离心1 min，取沉淀备用；取1 mL口鼻棉拭子培养液，1 000 r/min离心2 min，取上清，10 000 r/min离心2 min，取沉淀备用。使用西安天隆细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌核酸，支原体参照革兰氏阳性菌提取。

3.3 实验室RT-qPCR、qPCR检测

1）口蹄疫病毒RT-qPCR检测。使用世纪元亨口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-qPCR检测试剂盒对所提取核酸进行口蹄疫病毒核酸检测。RT-qPCR扩增体系（25 μL）：RT-qPCR反应液12.5 μL、酶混合液1 μL、无菌无核酸酶水6.6 μL、核酸模板2 μL。扩增程序：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，45个循环。

2）多杀性巴氏杆菌qPCR检测。使用维伯鑫牛巴氏杆菌qPCR检测试剂盒对所提取核酸进行巴氏杆菌qPCR检测，qPCR扩增体系（25 μL）：qPCR反应液19 μL、酶混合液1 μL、核酸模板5 μL。扩增程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

3）支原体qPCR检测。使用维伯鑫牛支原体qPCR检测试剂盒对所提取核酸进行支原体qPCR检测。qPCR扩增体系（25 μL）：qPCR反应液19 μL、酶混合液1 μL、核酸模板5 μL。扩增程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45个循环。

3.4 诊断结果

经过临床检查、病理剖检，结合生产实际，初步怀疑为多杀性巴氏杆菌或支原体等其他呼吸道病原微生物所致，经实验室分子生物学检测，结果显示：口蹄疫病毒核酸检测结果为阴性（图6），多杀性巴氏杆菌和牛支原体核酸检测结果为阳性（图7、图8）。诊断结果：该牛场本次发病为感染了牛多杀性巴氏杆菌及支原体。

4 诊治

4.1 消杀

结合该场实际情况，购入的牛隔离饲养，并且采用2%二氯异氰脲酸钠进行全场消毒，每2 d 1次。

4.2 治疗

治疗原则：对因治疗、对症治疗、强心补液。

1）针对症状较轻、关节肿大的病牛,操作如下：

①卡那霉素，25 mg/kg，肌肉注射，1次/d；

②泰乐菌素，15 mg/kg，肌肉注射，2次/d；

③安痛定，30 mL/头，肌肉注射（如体温正常或明显恢复站立，则停止使用）；

④静脉滴注，5%葡萄糖500 mL+肌酐+三磷酸腺苷+辅酶A；

⑤静脉滴注，0.9%氯化钠注射液500 mL+复合维生素B注射液+维生素C。

2）针对症状较重的病牛，操作如下：

①静脉注射，0.9%氯化钠500 mL+樟脑磺酸钠2 g+10%葡萄糖；

②静脉注射，0.9%氯化钠500 mL+科特壮25 mL；

③静脉注射，5%葡萄糖500 mL+维C（4 g）+地塞米松（20 mg）；

④肌肉注射，咳喘神针+岑连注射液；

⑤肌肉注射，氟尼辛葡钾胺，5 mg/kg。

4.3 治疗结果

经过治疗，该场除抢救无效死亡的患病牛外，其他患病牛基本恢复正常，病情得到控制，没有发生扩散，隔离场外其他健康牛均无感染。

5 讨论

近年来，普洱市大力发展肉牛产业，牛只频繁引入和调出，导致动物疫病传播风险不断增加。研究^[7]表明，引发牛呼吸道疾病的因素是多方面的，外源感染、长途运输、断奶、混群、气候变化等因素均可引发该病，特别是犊牛在运输过程中受拥挤、冷热交替、饥饿、疲劳等刺激后，更容易引发呼吸道疾病，故又将该类病俗称为“运输热”。在本病例中，该牛场在气温高热情况下频繁从外地购入牛只，牛经过长途运输后到达目的地进行饲养，后未采取降低应激反应措施，如空腹、停饲等，导致机体免疫力下降，又因到达目的地后未隔离观察就急于使用口蹄疫O型-A型二价灭活疫苗进行免疫注射，最终导致牛机体受到严重应激，进一步使牛的机体免疫能力下降，由此推测，这是一起由运输应激促发或引发的牛支原体和多杀性巴氏杆菌混合感染。因此，在购入或引入牛之后，有必要采取降低应激反应的有效手段，比如用牛经常食用的饲料喂养一段时间，减缓应激的发生；对应激反应较大的牛只，可以选择注射抗应激药物，如安定、氯丙嗪、维生素B₁₂、地西泮等缓解精神紧张的药物。

牛呼吸道疾病综合征的病原体较多，覆盖细菌、病毒、支原体等，本文详细叙述了支原体与多杀性巴氏杆菌混合感染引起的牛呼吸道疾病综合征的症状及诊断。牛支原体是常见的致病性病原体，主要存在患病牛的鼻腔或者乳腺中，通过呼吸道传播，同时也能通过精液或者胎盘进行垂直传播^[8]。巴氏杆菌是由多杀性巴氏杆菌引起的急性传染病，对多种动物有较强的致病性^[9]，该病发病急、类型多，并且长期寄生在动物的上呼吸道和消化黏膜，各种诱因使动物机体免疫力下降后导致发病。通过免疫和加饲养管理是预防该病的重要手段。

一旦发现患病牛要及时采取隔离，避免交叉感染，做到早发现、早隔离、早治疗。牛支原体感染的患病牛可以使用泰乐菌素注射液、泰妙菌素注射液、氟苯尼考注射液等针对支原体有效的抗生素治疗。该病易复发，治疗周期一般以3~5 d为宜；牛多杀性巴氏杆菌感染的患病牛可以使用磺胺类药物与头孢类、青霉素类抗生素联合用药进行治疗，并且牛多杀性巴氏杆菌病有疫苗，定期接种是预防该病的重要手段。治疗期间还可使用辅助治疗，如复合维生素B、三磷酸腺苷、维生素B₁₂、辅酶A等辅助治疗。

参考文献

[1] WERID G M, MILLER D, MESSELE Y, et al. An overview of the detection of bovine respiratory disease complex pathogens using immunohistochemistry: emerging trends and opportunities[J]. Journal of veterinary diagnostic investigation, 2024,36(1):12-23.

[2] BOOKER C W， LUBBERS B V. Bovine respiratory disease treatment failure: impact and potential causes［J］. The veterinary clinics of North America food animal practice， 2020，36（2）：487-496.

[3] NISSLY R H, ZAMAN N, IBRAHIM P A S, et al. Influenza C and D viral load in cattle correlates with bovine respiratory disease （BRD）: emerging role of orthomyxoviruses in the pathogenesis of BRD［J］. Virology， 2020，551：10-15.

[4] 刘永杰, 颜新敏, 刘萍, 一起牛呼吸道综合征病原分析和鉴定[J]. 中国兽医科学, 2024,54(9):1232-1239.

[5] 谢倩茹， 童胜涛， 邵咏旋， 牛呼吸道感染细菌病原的致病机理与防控研究进展［J］. 中国兽医学报， 2016，36（12）：2183-2188.

[6] 高阳， 张如， 宫士越， 某牛场牛呼吸道疾病的实验室诊断及防控措施［J］. 特产研究， 2023，214：861-865.

[7] 宋福超， 张学虎， 王兴仕， 一起牛感染支原体与多杀性巴氏杆菌的诊断与治疗［J］. 中国牛业科学， 2023，49（2）：92-96.

[8] 何晓玲. 牛支原体病的诊断与防控[J]. 今日畜牧兽医, 2024,40(3):20-22.

[9] 孔祥芬. 牛巴氏杆菌病的感染因素与防治[J]. 养殖与饲料, 2024,23(4):87-89.