杂交构树根、茎、叶总黄酮醇溶液的理化性质研究

Physico-chemical properties of total flavonol solution in roots, stems and leaves of hybrid Broussonetia papyrifera

摘要

[目的]系统探究杂交构树根、茎、叶总黄酮醇溶液的理化性质，分析不同部位中总黄酮的差异性。[方法]选取杂交构树中科1号101的根、茎、叶中提取的总黄酮醇溶液为原料，先通过特定仪器设备测定其表观特征、pH值、电导率值和抗氧化能力，再用电子扫描显微镜观察其特定处理后的微观特征。[结果]等体积杂交构树根、茎、叶总黄酮醇溶液颜色各异，均带易挥发乙/甲醇味；pH值均在6.3～7.0，且茎>根>叶，但差异不显著；电导率值无显著差异，均在966～1 000μS/cm；等浓度条件下总体上对DPPH、ABTS自由基的清除率分别为：茎部≥根部>叶部以及根部>茎部≥叶部；等浓度特殊干燥处理后的固体形貌存在极为明显的差异。[结论]杂交构树根、茎、叶总黄酮醇溶液在颜色、pH、电导率上差异不显著，但对自由基的清除率及干燥后固体形貌差异明显。杂交构树根部和茎部的总黄酮含量较高，具有开发成为抗氧化饲料添加剂的潜力。

关键词

杂交构树 / 根 / 茎 / 叶 / 总黄酮 / 理化性质 / 抗氧化功能

Key words

hybrid Broussonetia papyrifera / roots / stems / leaves / total flavone / physico-chemical properties / antioxidant fuction

杂交构树（hybrid Broussonetia papyrifera）是桑科构属的野生构树经中国科学院植物研究所科研团队通过太空搭载和杂交选育等技术培育的一种新品种植物，具有极强的抗盐碱、贫瘠、湿热和干冷生长的特性，其可在海拔1 600~2 000 m的山川、丘陵等地形中生长^[1]。杂交构树中含有的黄酮类化合物在饲用和抑制禽类病原菌等药用方面发挥着重要作用^[2-4]，研究表明杂交构树中总黄酮具有较强的总还原能力和较好的抗氧化活性^[5-7]，然而对杂交构树不同部位中总黄酮的系统差异性研究尚未见报道。本研究以杂交构树根、茎、叶中提取的总黄酮醇溶液为原料，通过物理和化学相结合的方法，对杂交构树的根、茎、叶总黄酮的理化性质进行研究，以期为杂交构树总黄酮的进一步开发和应用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 材料、试剂与仪器

杂交构树根、茎、叶总黄酮是由河南省杂交构树工程技术研究中心从生长于兰考构树试验示范基地种植区1~2年生、株高140 cm杂交构树中科1号101的根、茎、叶中获得的醇提液。

桶装5 L纯净水、无水乙醇、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）。

MX-S漩涡混匀振荡器（大龙兴创实验仪器(北京)股份公司），PHS-3E型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司），DZS-706电导率仪（上海仪电科学仪器股份有限公司），TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），Quanta-200扫描电子显微镜（美国FEI公司）。

1.2 表观特征

取等量的杂交构树根、茎、叶总黄酮醇提液分别盛放于3个同样大小的透明玻璃安瓿瓶中，在自然光线下使用高清数码相机拍照。

1.3 pH值测定

安装好仪器和电极后，分别准备pH 4.00、6.86、9.18的KH₂PO₄标准缓冲溶液进行标定，将电极下端的保护瓶取下，拉下电极上端橡皮套，使其露出上端小孔，用纯净水清洗电极，测定样品的pH^[8]。

1.4 电导率值测定

安装好仪器和电极后，准备1 408 μS/cm KCl标准溶液，放入25 ℃恒温水浴中，取下电极下端的保护瓶，用纯净水清洗电极，测定样品的电导率^[9]。

1.5 抗氧化指标测定

1）清除DPPH自由基活性。称取0.003 94 g DPPH粉末，加入100 mL无水乙醇中，充分混合后得到0.1 mmol/L的DPPH溶液100 mL。往10 mL棕色容量瓶中各加入1.0 mL分别为0（空白，测定无水乙醇与DPPH溶液的吸光度）、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的杂交构树总黄酮醇提取液，然后加入5 mL的DPPH溶液，最终用无水乙醇定容至10 mL，振荡混匀。空白组：将样品组的杂交构树不同部位总黄酮醇溶液替换为无水乙醇。将样品组和空白组在黑暗条件下静置30 min，测定其在517 nm紫外波长处的吸光值^[10]。计算其DPPH清除率：

DPPH清除率=（D ₁‒D ₀）÷D ₁×100%（1）

式中：D ₀为样品、DPPH溶液与无水乙醇混合定溶液的吸光度；D ₁为无水乙醇与DPPH溶液的吸光度。

2）清除ABTS自由基活性。配制7 mmol/L ABTS溶液和2.5 mmol/L过硫酸钾溶液各50 mL，将其混合均匀，室温避光静置14~16 h，得ABTS储备液。取ABTS储备液适量，用蒸馏水将其稀释至734 nm处吸光度值为（0.7±0.02），即得ABTS工作液。分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的杂交构总黄酮醇提取液各1.0 mL于棕色容量瓶中，再加入ABTS工作液4.0 mL。空白组：将样品组中的杂交构树不同部位总黄酮醇溶液替换为去离子水。将样品组和空白组在黑暗环境中静置6 min后，测定其在734 nm波长处的吸光值^[11]。清除率计算公式：

ABTS清除率=（1‒D ₀/D ₁）×100%（2）

式中：D ₀为样品组的吸光度；D ₁为空白组的吸光度。

1.6 扫描电子显微镜观察

将同一浓度的杂交构树根、茎、叶总黄酮醇提液依次过粒径为0.3~0.5 mm HPD600大孔树脂层析柱、无水乙醇洗脱、70~75 ℃旋蒸浓缩、-40 ℃冷冻真空干燥至恒质量^[12-13]，然后蘸取适量样品粘在载物柱子台面的导电黑色双面胶上面，用吹风机吹掉浮在表面或未完全粘牢的样品，将载物柱子插在镀金仪器载物台对应的限位孔中进行喷碳镀金处理，置入加速电压为12 kV的扫描电子显微镜中观察。

1.7 统计学分析

用EXCEL汇总数据，用SPSS 20.0 软件作图，用“平均值±标准差”表示试验数据分析结果，“^**” “^***”分别表示P＜0.05、P＜0.01。

2 结果与分析

2.1 颜色、嗅觉表观特征

如图1所示，相同体积的杂交构树根、茎、叶总黄酮醇溶液在颜色上分别呈现出一定的、肉眼可见的暗红偏黄色（图1A）、暗黄偏绿色（图1B）、墨绿偏黑色（图1C）。此外，密闭容量瓶在无风室内开盖后经多人嗅觉鉴定，发现杂交构树根、茎、叶总黄酮醇溶液均含有1种较容易嗅到的挥发性乙醇气味，随着嗅觉次数的增加，其气味有点类似挥发性甲醇。

2.2 pH值测定结果

由图2可知，杂交构树不同部位总黄酮醇溶液的pH值高低为：茎＞根＞叶，均大于6.3且小于7.0，但差异不显著（P＞0.05）。

2.3 电导率测定结果

由图3可知，杂交构树不同部位总黄酮醇溶液的电导率值几乎无明显差异（P＞0.05），均大于966 μS/cm且小于1 000 μS/cm。

2.4 抗氧化指标测定结果

由图4可知，杂交构树不同部位总黄酮醇溶液在相同及不同浓度条件下对DPPH自由基的清除率存在不同程度的差异。随着样品质量浓度的增加，根部、茎部总黄酮醇溶液对DPPH自由基的清除率分别呈略微下降、增加趋势，而叶部呈极为明显的下降趋势。当质量浓度为0.1 mg/mL时，根部和叶部对DPPH自由基的清除率相当，且高于茎部，但三者之间差异不显著（P＞0.05）；在0.2~0.5 mg/mL时，根部、茎部、叶部总黄酮醇溶液在相同质量浓度条件下对DPPH自由基清除率的差异均极显著（P＜0.01），且遵循“茎部≥根部＞叶部”的规律。

由图5可知，在相同质量浓度条件下，杂交构树不同部位总黄酮醇溶液对ABTS自由基清除率的差异总体上呈极显著（P＜0.01），根部＞茎部≥叶部。另外，随着样品质量浓度的增加，不同部位对ABTS自由基的清除率均呈递增趋势，尤以茎部、叶部表现最为明显，当根部质量浓度≥0.3 mg/mL时，对ABTS自由基的清除率趋于稳定。

2.5 扫描电子显微镜结果及分析

由图6可见，不同部位中总黄酮的固体形貌存在明显差异。根部总黄酮除极少量小块外，均呈长6 μm、宽 2.5 μm以上多层叠加的大团块状；茎部总黄酮呈长宽不一、形状各异的黏连块状，以小块居多；而叶部总黄酮几乎呈类似于鱼鳞纹路的大板块状。

3 讨 论

3.1 颜色、嗅觉表观特征

黄酮类化合物颜色多变，易受分子结构（如酚羟基、γ-吡喃环及共轭体系）影响，同时受植物部位、生长环境、生理功能、代谢途径差异导致的种类、含量变化及次生代谢、细胞壁稳定、光合色素等因素调控。此外，光照、温度、水分等环境因素也通过影响色素合成、分解及酶活性调节而作用于黄酮颜色^[14-16]。因此，根系作为植物的营养与运输器官，富含次生代谢产物，与黄酮类化合物相互作用使杂交构树根总黄酮醇溶液显现暗红偏黄色调^[17-18]。茎部作为支撑与运输结构，其黄酮类化合物可能主要参与细胞壁构建与稳定，导致茎部总黄酮醇溶液呈暗黄偏绿色^[19]。叶片作为光合作用的主要场所，含有丰富的叶绿素及光合色素，与黄酮类化合物的相互作用可能使杂交构树叶总黄酮醇溶液呈墨绿偏黑色^[20]。

嗅觉气味提示提取过程中乙醇溶剂的残留或黄酮成分本身可能具有类似乙醇的挥发性特征，值得注意的是，随着对气味感知次数的增加，该气味逐渐呈现出与挥发性甲醇相似的微妙变化，这一感知差异需要进一步的化学分析来验证其准确性及潜在原因。

3.2 pH值

所有部位的pH值均维持在弱碱性范围内（6.3~7.0），表明其均呈弱碱性，pH值差异不显著（P＞0.05），意味着植物总黄酮的酸碱性质受部位影响较小，而是受植物整体生理调控而非单一组织特性主导，或受其他更为复杂的因素影响，未能在本研究中显著体现^[21]。因此，后续需进一步探讨影响植物总黄酮醇溶液pH值的具体因素及其生物学意义。

3.3 电导率

杂交构树不同部位总黄酮醇溶液的电导率值无显著差异，表明其在电导率这一物理性质上具有相似性，或其分子结构和溶解度对电导率的影响相互抵消；电导率值均在966~1 000 μS/cm，说明杂交构树不同部位总黄酮在醇溶液中的导电能力具有一定的稳定性和均匀性。此外，电导率的测定结果也可以为杂交构树总黄酮醇溶液的品质控制提供参考，因为电导率的稳定性可能与溶液的均一性和纯度有关^[22]。

3.4 抗氧化效果

杂交构树不同部位总黄酮醇溶液对DPPH自由基的清除能力具有浓度依赖性和部位差异性，这与红柳、黄毛耳草和荔枝果实不同部位总黄酮醇溶液在DPPH抗氧化方面的结果相似^[23-25]。低浓度下，根、叶部总黄酮醇溶液清除率相近且高于茎部，但差异不显著。随着浓度提升，茎部总黄酮醇溶液表现出更强的清除能力，而叶部则大幅下降，根部则略有降低，显示茎部总黄酮醇溶液在高浓度下更具潜力。这一规律提示，杂交构树各部位总黄酮醇溶液抗氧化活性不同，应用时应考虑浓度与部位的选择，以优化其抗氧化效果。

杂交构树各部位总黄酮醇溶液对ABTS自由基的清除能力存在显著差异，根部效果最优，茎、叶部相当但稍逊，此差异极显著（P＜0.01），表明部位差异对总黄酮醇溶液抗氧化活性有显著影响。这与柴胡^[26]、北柴胡^[27]的根、茎、叶总黄酮醇溶液对ABTS自由基清除能力的结果刚好相反，显然根、茎、叶总黄酮醇溶液对ABTS自由基的清除能力也因不同植物而异。随着浓度提升，各部位清除率均上升，茎部和叶部尤为敏感，提示存在浓度依赖性增强效应。然而，根部在较高浓度时清除率趋于稳定，说明其抗氧化作用可能存在特定浓度饱和效应^[28-29]。若进一步探究黄酮成分差异，以优化提取和利用策略，可提升特定部位的抗氧化应用效能。

3.5 杂交构树不同部位的微观表征

扫描电子显微镜因其具有所需观察样品制备简单、肉眼无法企及的微观放大倍数、较高分辨率和图像立体感等优点，而常被用作检测样品的微观表面结构特征^[30]。黄酮类化合物多为结晶性固体，少数（如黄酮苷类）为无定形粉末^[31]。分析本研究的结果不难发现，杂交构树不同部位总黄酮块/粒径大小：叶＜茎＜根。显然，这与黄酮类化合物的固体形状有关。另发现，杂交构树不同部位总黄酮固体形貌松散程度：根＜叶＜茎，这可能与不同部位中的黄酮苷类含量，以及黄酮苷类中含有的糖分子结构致使呈现黏连状态不一有关^[32]。

4 结 论

在特定条件下，杂交构树根、茎、叶中总黄酮醇表现出显著差异。各部位的总黄酮醇溶液呈现不同颜色，均带有易挥发的乙/甲醇气味。pH值测定结果显示，各部位均接近中性，茎部略高于根和叶，但差异未达显著性。电导率测定亦未发现三者间存在显著差异。在抗氧化性能评估中，茎部表现出最强的抗氧化活性，而叶部相对较弱。经过特定干燥处理后，根、茎、叶的固体形态展现出显著的形态学差异。鉴于此，杂交构树根部和茎部所含的总黄酮具有开发成为抗氧化饲料添加剂的潜力。

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基金资助

河南省科学院基本科研业务费项目(230614047)

河南省科学院科技创新平台培育与提升项目(241014008)