抗菌肽PG-3对小鼠肠道屏障的影响

Effects of antimicrobial peptide PG-3 on the function of intestinal barrier in mice

摘要

[目的]研究抗菌肽PG-3对哺乳动物肠道屏障功能的影响，为畜牧业生产中抗生素的替代提供依据。[方法]选取36只6周龄雄性小鼠，随机分为3组（每组12只），即磷酸缓冲盐溶液组（对照CON组）、鼠伤寒沙门菌（ST）组、鼠伤寒沙门菌和抗菌肽复合组（ST+AMPS），连续饲喂14 d，测定MDA含量、SOD、GSH-Px、MPO活性。[结果]饲喂ST后，与CON组相比，MDA含量提高0.18 nmol/mg,SOD活性降低3.15 U/mg,MPO活性提高1.1 U/g,GSH-Px活性降低0.09 nmol/L。饲喂抗菌肽PG-3后，与CON组相比，MDA含量提高0.02 nmol/mg,SOD活性降低0.48 U/mg,MPO活性降低0.005 U/g,GSH-Px活性提高0.02 nmol/L。[结论]抗菌肽PG-3可以让感染鼠伤寒沙门菌的小鼠机体质量恢复到正常水平，有明显的抗菌抑菌作用，同时对动物机体抗氧化能力具有保护作用。

关键词

抗菌肽 / 抗氧化能力 / 超氧化物歧化酶 / 谷胱甘肽过氧化物酶 / 丙二醛

Key words

antimicrobial peptides / antioxidant capacity / superoxide dismutase (SOD) / glutathione peroxidase / malondialdehyde

自20世纪50年代起，抗生素在提高动物生产性能和疫病防治中发挥重要作用^[1]。抗生素滥用带来的细菌耐药性以及抗生素在动物性产品中残留也日益严重。2006年欧盟国家已全面禁止将抗生素添加到畜禽饲料中，我国畜牧业也逐步减少甚至禁止使用饲用抗生素，因此寻找抗生素替代物成为近年来研究的热点。

1980年，通过诱导首次发现了具有抗菌活性的多肽^[2]。王欢^[3]研究发现自然状态下的抗菌肽具有选择性免疫激活和调节功能。抗菌肽对细菌、部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有较强的抑制作用，以及促进伤口愈合、抑制LPS诱导的促炎应答、白细胞招募、趋化因子产生和抗炎特性等作用。

猪源抗菌肽（PG）家族^[4]包括PG-1、PG-2、PG-3、PG-4和PG-5以及几十种人工合成的突变体。其中，PG-3主要由肠道上皮细胞分泌而来，是一类富含脯氨酸的小分子阳离子多肽^[5]。本研究对感染鼠伤寒沙门菌的小鼠机体进行药物试验，测定使用药物后小鼠体质量、MDA含量、SOD、GSH-PX、MPO活性的变化，探讨抗菌肽PG-3对机体的抗菌抑菌作用^[6-8]，旨在为畜牧业生产中抗菌肽PG-3替代抗生素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

因小鼠代谢过程和猪较相似并具有个体较小、样品易获取、易设置、多重复数等优点，故采用小鼠代替仔猪进行试验。本试验选取36只6周龄雄性小鼠，先进行1周左右的适应性饲喂，结束后，按照体质量将小鼠随机分为3组（每组12只）：磷酸缓冲盐溶液组（CON）、鼠伤寒沙门菌组（ST）、鼠伤寒沙门菌和抗菌肽复合组（ST+AMPS）。CON组灌胃等量的磷酸缓冲盐溶液（PBS），ST+AMPS组灌胃规格为0.1 mL/100 μg的PG-3蛋白溶液0.1 mL，每天灌胃1次，连续14 d，在试验期第8天，ST组和ST+AMPS组加灌胃0.1 mL 10⁶ CFU/mL伤寒沙门菌。

1.2 小鼠样本的准备、分组及处理

无特定病原体（SPF）级别雄性小鼠，来自北京HFK生物科学公司（C57BL/6；6周龄）。在试验中，小鼠被单独关在笼中，笼中装有塑料地板和铁网盖。鼠房为标准的饲养条件：温度为（25±2） ℃，相对湿度为（50±5）%，照明周期为12 h/d）。小鼠可以自由获得饲料和饮用水。

1.3 试验方法

1）髓过氧化物酶（MPO）测定^[9]。采用南京建成试剂盒进行测定，方法：比色法，步骤如下：

①将试剂盒从4 ℃冰箱中取出；20 mL的试剂一贮备液加入180 mL灭菌水中配成缓冲溶液；

②试剂二粉剂加入30 mL缓冲溶液中得到试剂二溶液；

③将试剂五粉剂加入100 mL缓冲溶液中，使用小型振荡仪充分混合均匀，完全溶解后加入试剂六0.1 mL，使用小型振荡仪充分混合均匀，配好显色剂，用锡箔纸包裹严实，避光保存；

④将超声得到的组织匀浆按1∶1体积比加入配好的试剂二；

⑤取54 μL组织匀浆加三号试剂6 μL，使用小型振荡仪充分混合均匀后，37 ℃恒温水浴锅水浴15 min，取出待测；

⑥按表1进行操作并使用小型振荡仪充分混合均匀，在37 ℃恒温水浴锅中水浴30 min(试剂七不用此步骤)，对照管与测定管每组样本3个重复。

⑦使用小型振荡仪充分混合均匀，60 ℃恒温水浴锅水浴10 min，取出后立即在460 nm处，1 cm光径，灭菌水调零，测各管吸光度值。

⑧按照公式进行计算：

\mathrm{M} \mathrm{P} \mathrm{O} \mathrm{活力} = \frac{\mathrm{测定}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}-\mathrm{对照}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}}{\mathrm{11.3}\times \mathrm{取样}\mathrm{量}}

2）超氧化物歧化酶（SOD）测定^[10]。采用南京建成试剂盒进行测定，货号：A001-1，方法：羟胺法，步骤如下：

①将试剂盒从4 ℃冰箱中取出；

②将试剂一贮备液37 ℃热水浴溶解，取1 mL贮备液加入9 mL灭菌水稀释至10 mL，配成试剂一溶液；

③取200 μL试剂四贮备液与2 800 μL试剂四稀释液混合，配成试剂四溶液；

④将试剂五粉剂加入75 ℃灭菌水37.5 mL（事先调好水浴锅的温度）溶解，用锡箔纸包裹严实避光保存；

⑤将试剂六粉剂加入37.5 mL灭菌水溶解，用锡箔纸包裹严实避光保存；

⑥取12 mL试剂五溶液与12 mL试剂六溶液与8 mL冰乙酸混合，配显色剂，用锡箔纸包裹严实避光保存；

⑦按表2操作并使用小型振荡仪充分混合均匀，在37 ℃恒温水浴锅中水浴40 min，测定管每组样本3个重复，对照管每组样本2个重复。

⑧使用小型振荡仪充分混合均匀，室温静置10 min；

⑨使用酶标仪调到波长为550 nm，并用灭菌水调零;

⑩按公式进行计算：

\mathrm{总} \mathrm{S} \mathrm{O} \mathrm{D} \mathrm{活力} = \frac{\mathrm{对照}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}-\mathrm{测定}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}}{\mathrm{对照}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}} ÷ \mathrm{50} \mathrm{\%} \times \frac{\mathrm{反应}\mathrm{液总}\mathrm{体积}}{\mathrm{取样}\mathrm{量}} ÷ \mathrm{待测} \mathrm{样本} \mathrm{蛋白} \mathrm{浓度}

3）谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定。采用南京建成试剂盒进行测定，货号：A005-1，方法：比色法，步骤如下：

①将试剂盒从4 ℃冰箱中取出；

②向10 μL试剂一贮备液中加入灭菌水至1 mL，充分溶解，配为试剂一溶液；

③取试剂二的上清液配为试剂二溶液；

④将试剂三粉剂加入200 mL灭菌水溶解；

⑤将试剂四粉剂加入50 mL灭菌水溶解，用锡箔纸包裹严实避光保存；

⑥将试剂五粉剂加入10 mL灭菌水溶解，用锡箔纸包裹严实避光保存；

⑦将1 mL GSH标准品溶剂贮备液加入9 mL灭菌水配制成为GSH标准品溶剂溶液；将3.07 mg GSH标准品加入10 mL GSH标准品溶剂溶液中，使用小型振荡仪充分混合均匀，配制1 mmol/L GSH标准品溶液；取1 mmol/L GSH标准品溶液0.2 mL加入9.8 mL GSH标准品溶剂溶液中，使用小型振荡仪充分混合均匀，配为20 μmol/LGSH标准品溶液；

⑧取待测样本40 μL，加入试剂一溶液160 μL，使用小型振荡仪充分混合均匀，3 500~4 000 r/min离心10 min，取上清液150 μL进行酶促反应；

⑨按表3操作并在37 ℃恒温水浴锅中水浴5 min。

⑩使用小型振荡仪充分混合均匀，在离心机3 500~4 000 r/min离心10 min，然后取上清液150 μL作显色反应；

⑪按表4操作显色反应：

使用小型振荡仪充分混合均匀，在室温下放置15 min。

⑫使用酶标仪，调到波长为412 nm处，用灭菌水调零，测定每个孔板的吸光度值。

⑬按公式进行计算：

\mathrm{G} \mathrm{S} \mathrm{H} - \mathrm{P} \mathrm{x} ( \mathrm{酶活} \mathrm{力} ) = \frac{\mathrm{非酶}\mathrm{管}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}-\mathrm{酶管}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}}{\mathrm{标准}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}-\mathrm{空白}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}} \times \mathrm{标准} \mathrm{管浓} \mathrm{度} \times \mathrm{稀释} \mathrm{倍数} ( \mathrm{5} ) ÷ \mathrm{反应} \mathrm{时间} ÷ ( \mathrm{取样} \mathrm{量} \times \mathrm{样本} \mathrm{蛋白} \mathrm{含量} )

4）丙二醛（MDA）含量测定。采用南京建成试剂盒进行测定，货号：A003-1，方法：TBA法，步骤如下：

①将试剂盒从4 ℃冰箱中取出；

②将试剂一在37 ℃恒温水浴锅中水浴加温以便溶解，直至透明；

③取试剂二600 μL加入17 mL灭菌水，使用小型振荡仪充分混合均匀，制备为试剂二溶液；

④取试剂三粉剂0.09 g加入90~100 ℃灭菌水6 mL中（提前在水浴锅中加热好灭菌水），使用小型振荡仪充分混合均匀至充分溶解，再加6 mL冰醋酸，制备为试剂三溶液即显色剂，用锡箔纸包裹严实避光保存；

⑤按表5操作。

⑥使用小型振荡仪充分混合均匀，95 ℃恒温水浴锅中水浴60 min，取出后流水冷却，然后在离心机4 000 r/min离心10 min，完全沉淀，取上清液150 μL。

⑦使用酶标仪调到波长为532 nm处，并用灭菌水调零，测定每个孔板的吸光度值；

⑧按公式进行计算：

\mathrm{M} \mathrm{D} \mathrm{A} \mathrm{含量} = \frac{\mathrm{测定}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}-\mathrm{对照}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}}{\mathrm{标准}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}-\mathrm{空白}\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{值}} \times \mathrm{标准} \mathrm{品浓} \mathrm{度} ÷ \mathrm{待测} \mathrm{样本} \mathrm{蛋白} \mathrm{浓度}

1.4 数据分析

试验数据通过Excel、SPSS软件进行处理。结果以“平均值±标准差”来表示。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽PG-3对小鼠生长性能的影响

由图1可知，与CON组相比，饲喂ST组的小鼠每日体质量逐渐减小，显著低于CON组。而饲喂抗菌肽PG-3后，与ST组相比，小鼠每日体质量显著增加；与CON组相比，差异不显著。推断饲喂抗菌肽PG-3后可缓解伤寒沙门氏菌的影响。

2.2 抗菌肽PG-3对小鼠结肠组织抗氧化能力的作用

1）丙二醛（MDA）含量。MDA可以反映机体内脂质过氧化物程度，间接地反映出细胞损伤的程度。由表6可知，ST组MDA含量分别显著高于CON组、ST+AMPS组0.18、0.16 nmol/mg，而ST+AMPS组又略高于CON组0.02 nmol/mg，但差异不显著。说明使用抗菌肽能够显著降低动物体内脂质过氧化物程度，缓解细胞损伤的程度，有效抑制细菌侵害。

2）超氧化物歧化酶（SOD）活性。SOD主要作用是清除氧自由基和体内垃圾。

由表7可知，ST组SOD活性分别低于CON组、ST+AMPS组3.15、1.93 U/mg，差异不显著。说明ST组处理使机体抗氧化能力下降，防御自由基能力下降，从而表现为SOD活性降低，而添加有抗菌肽能有效提高机体抗氧化能力，缓解细菌入侵机体时SOD活性的降低程度。

3）髓过氧化物酶（MPO）活性。MPO代表体内内皮细胞受损伤程度，各种感染会导致体内出现炎症反应，而MPO偏高可能是炎症的一种表现。由表8可知，ST组MPO活性分别高于CON组、ST+AMPS组1.1、1.4 U/g，ST+AMPS组略低于CON组0.3 U/g，差异不显著。说明ST处理使动物体体内内皮细胞受到损伤，感染会导致机体出现炎症反应，身体的防御机制被激活，从而表现为MPO升高，而抗菌肽能有效缓解机体感染程度降低细胞受损程度。

4）谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。GSH-Px是一种重要的抗氧化酶，它可以保护机体细胞免受氧化应激损伤。由表9可知，ST组GSH-Px活性显著低于CON组0.09 nmol/L，而ST+AMPS组略低于CON组0.02 nmol/L，说明ST组中当细菌病原侵入生物体时会引起细胞受到氧化应激损伤。这时，谷胱甘肽过氧化物酶为了清除过多的过氧化物，会大量消耗，从而导致其水平降低。而抗菌肽能有效抑制细菌病原侵入机体降低感染程度，降低细胞受损程度。

3 讨 论

在正常情况下，小鼠体质量呈缓慢上升趋势^[11-12]，采用伤寒沙门氏菌灌胃后，小鼠每日体质量逐渐减少，而对伤寒沙门氏菌灌胃的小鼠在饲喂抗菌肽PG-3后，每日体质量减少趋势变得平缓^[13]。由此推论出抗菌肽PG-3对于被ST组损伤的小鼠的生长性能有促进作用。

机体内存在的抗氧化系统^[11]包括SOD、MDA、MPO、GSH-PX，可及时清除机体自身产生的氧自由基，而当氧自由基超过了能自我清除的最大限度时，就会造成组织损伤。当细菌病原微生物入侵动物体时，动物组织中MDA含量升高、MPO活性也有上升趋势，而抗菌肽能够有效抑制细菌病原微生物对动物体的感染^[14]，从而降低MDA、MPO指标；维持动物机体正常状态下的SOD活性、GSH-PX活性，表明抗菌肽对于动物组织的抗氧化能力的损伤有缓解作用，能起到保护作用。

未来，可以基于抗菌肽PG-3的结构，深入解析抗菌肽PG-3的抗菌机制，利用先进的技术手段，从原子和分子水平上进一步了解抗菌肽PG-3，探析抗菌肽PG-3与细菌细胞膜的相互作用过程、对细菌细胞内生理过程的影响、与细菌细胞膜的结合能力和作用效率以及在机体防御感染中的作用机制和潜在应用价值，拓宽抗菌肽PG-3抗菌谱等^[15]，为其优化改造和实践应用提供更深入的理论依据。

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