连花清瘟方剂对巴氏杆菌和猪丹毒丝菌的抗菌作用

The antibacterial effects of Lianhua-Qingwen formula on Pasteurella multocida and Erysipelothrix rhusiopathiae

摘要

[目的]分析中药连花清瘟方剂对2种常见畜禽病原菌（巴氏杆菌、猪丹毒丝菌）的抗菌作用，为其在兽医临床中的应用提供参考。[方法]首先，通过微量肉汤稀释法测定连花清瘟方剂对巴氏杆菌3株不同菌株（巴氏杆菌X7株、巴氏杆菌YU株、巴氏杆菌SD株）的最小杀菌浓度（MBC）和最小抑菌浓度（MIC）。然后，进行药物治疗试验。取4～6周龄小鼠50只，分为5组，巴氏杆菌攻毒后给予各组不同的治疗方案（连花清瘟方剂、无菌水、阿莫西林、头孢克洛）治疗3 d，通过治疗有效率评价连花清瘟方剂对巴氏杆菌感染的治疗效果；参照连花清瘟方剂抗巴氏杆菌的试验方法，测定连花清瘟方剂对猪丹毒丝菌的MIC、MBC和治疗有效率。[结果]连花清瘟方剂对巴氏杆菌不同菌株的MIC和MBC分别为4～8、8～16 mg/mL，对巴氏杆菌感染的治疗有效率为60%，显著高于对照组，与抗生素灌服组治疗无显著差异。连花清瘟方剂对猪丹毒丝菌SE38株的MIC值为64 mg/mL,MBC值为128mg/mL，小鼠感染模型中无显著治疗效果。[结论]连花清瘟方剂对巴氏杆菌具有较好的抗菌效果，可作为抗菌药替代品进一步研究。

关键词

连花清瘟方剂 / 巴氏杆菌 / 猪丹毒丝菌 / 减抗 / 替抗 / 治疗有效率

Key words

Lianhua-Qingwen formula / Pasteurella multocida / Erysipelothrix rhusiopathiae / reduction of antibiotics / substitutes for antibiotics / efficacy of treatment

细菌耐药正成为受到全球关注的重大公共卫生问题，“兽用抗菌药使用减量化行动”（简称“减抗行动”）是我国政府农业管理部门采取的重要应对措施^[1]。抗菌药替代品是保障减抗行动顺利施行的重要支撑，其研究热点之一是中药^[2]。但是目前研究有限，临床上具有良好效果的替抗中药产品较少。连花清瘟方剂（颗粒或胶囊）是在抗SARS期间研制成功的新中药^[3]，在之后新冠肺炎的治疗中发挥了重要作用。尽管有报道^[4]表明连花清瘟方剂对病原菌具有一定抑制作用，但目前连花清瘟方剂在抗菌方面的研究还很少，尤其缺乏连花清瘟方剂抗动物病原菌的研究，制约了该药在减抗行动上的应用。

巴氏杆菌（主要是多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)，造成多种动物巴氏杆菌病（Pasteurellosis），如牛运输热、牛出血性败血症、猪肺疫、禽霍乱等^[5]。巴氏杆菌近年来在多种动物中的临床分离率或检出率都位居前列。猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)又称猪丹毒杆菌，是一种兼性厌氧型革兰阳性杆状细菌^[5]，可以造成猪、羊、火鸡、麝香、驯鹿、驼鹿等动物的丹毒病^[6]，也是养殖场的常见病原菌。本研究分析了连花清瘟方剂对巴氏杆菌和猪丹毒丝菌的抗感染作用，旨在为连花清瘟方剂作为抗菌药替代品应用于减抗行动进行探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物及菌株

SPF级昆明小鼠，雌雄各半，体质量20～25 g，购自斯贝福（北京）有限公司；巴氏杆菌X7株（CpsA：L1型）、YU株（CpsA：L6型）、SD株（CpsF：L3型）、猪丹毒丝菌SE38株，均由河北农业大学动物医学院保存并提供。

1.2 主要相关试验试剂

胰蛋白大豆琼脂(TSA)、胰蛋白大豆肉汤(TSB)、马丁肉汤培养基分别购自青岛海博生物有限公司、琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司、新生牛血清购自平睿生物科技（北京）有限公司，连花清瘟颗粒购自石家庄以岭药业股份有限公司，阿莫西林购自石药集团中诺药业有限公司，头孢克洛购自华北制药河北华民药业有限责任公司。

1.3 菌液以及药品的制备

将甘油保存的巴氏杆菌、猪丹毒丝菌菌种从-80 ℃冰箱取出。待菌种融化后，用火焰灼烧后的接种环经划线接种至含5%新生牛血清的TSA固体培养基上，放入37 ℃恒温箱进行培养。挑取单菌落转接至含5%新生牛血清的TSB液体培养基内，37 ℃、180 r/min条件下培养至对数生长期。培养出的菌液进行平板菌落计数后用马丁肉汤稀释至相应的浓度（1×10⁸ CFU/mL）备用。

使用电子天平精确称取连花清瘟颗粒6.4 g，置于25 mL容量瓶中，再用无菌蒸馏水定容至25 mL，获得质量浓度为256 mg/mL的药液，4 ℃保存备用。

1.4 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定

取8支2 mL EP试管，各加入800 μL马丁肉汤培养基，再向第1支试管中加入800 μL预先配制好的药物溶液，混匀后从第1支试管吸取800 μL液体加入第2支试管，以此类推，得到8支试管的药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1 mg/mL。向各试管中加入50 μL提前制备的细菌菌液，另外以50 μL菌液加800 μL培养基和800 μL蒸馏水作对照组。每管吸取200 μL药物菌液加入到96孔板中，用酶标仪测定630 nm下菌液的OD值。然后将EP管置于37 ℃恒温摇床内，以180 r/min培养24 h。培养结束后，每管吸取200 μL菌液加入到96孔板中，测定630 nm下菌液的OD值。

每管药物菌液0 h和24 h的OD值对比，以OD_{24 h}≤OD_{0 h}的EP管内最低药物浓度为MIC。从各管内取肉汤培养物100 μL，分别接种涂布于血琼脂TSA平板（含5%脱纤维绵羊血）上，37 ℃培养24 h，观察细菌生长情况，平皿计数结果中菌落数量小于10 CFU的EP管的最低药物浓度为最低杀菌浓度(MBC)。

连花清瘟方剂对猪丹毒丝菌的MIC和MBC测定方法与巴氏杆菌的方法相同，所用培养基为TSA或TSB培养基。

1.5 小鼠感染模型的建立

参照文献[7-8]中建立的感染模型进行试验，分别使用巴氏杆菌X7株和猪丹毒丝菌SE38株攻毒建立巴氏杆菌和猪丹毒丝菌的小鼠感染模型。各病原菌感染模型分别设立试验组、对照组及健康对照组，每组10只小鼠。试验组和对照组小鼠皮下注射巴氏杆菌或猪丹毒丝菌100 CFU/支（巴氏杆菌：10×LD₅₀；猪丹毒丝菌：20×LD₅₀），攻毒后对试验组小鼠灌服药物治疗，对照组小鼠灌服等体积的无菌水。健康对照组饲养于同一空间，饲养条件相同，但不攻毒和治疗，连续7 d观察记录小鼠发病死亡情况。

1.6 最优给药剂量确定

取小鼠50只，雌雄各半，混合后随机分为9组（6组试验，2组对照，1组健康对照），每组5只（健康对照组10只），各组在巴氏杆菌攻毒后均治疗3 d（表1）。A、D组为低剂量给药组，每天每只小鼠的给药剂量为2.5 g/kg（连花清瘟方剂质量/小鼠体质量，下同），A组每天分3次灌服，D组则每天1次灌服给药；B、E组为中剂量给药组，每天每只小鼠给药剂量为5.0 g/kg，B组每天分3次灌服，E组每天1次灌服给药；C、F组为高剂量给药组，每天每只小鼠给药剂量为10.0 g/kg，C组每天分3次灌服，F组每天1次灌服给药。对照组小鼠灌服等体积蒸馏水，每天3次和1次。健康对照组饲养于同一空间，不攻毒和灌药治疗。观察给药后小鼠的精神、行为等状态，判断有无毒副反应；观察巴氏杆菌攻毒后小鼠存活率。

1.7 药物治疗试验

1）巴氏杆菌感染的治疗。取小鼠50只，分为5组，每组包含5只雌鼠和5只雄鼠，巴氏杆菌攻毒后给予各组不同的治疗方案治疗3 d。第1组给予连花清瘟方剂治疗，按照“文中1.6”所确定的最优给药剂量和方式给药；第2组和第3组分别给予阿莫西林和头孢克洛治疗，给药剂量（按照药物说明书推荐剂量，由人用剂量换算至小鼠剂量^[9]）分别为每天228、114 mg/kg，给药方式与连花清瘟方剂相同；第4组为对照组，灌服等体积的无菌水治疗；第5组为健康对照组。连续7 d每天观察记录小鼠的发病死亡情况，计算治疗有效率（存活小鼠数量/该组小鼠数量）。

2）猪丹毒丝菌感染治疗。取小鼠30只，分为3组（由于预试验显示治疗效果不佳，故未设置抗生素治疗组），每组包含5只雌鼠和5只雄鼠，猪丹毒丝菌攻毒后给予各组不同的治疗方案治疗3 d。第1组给予连花清瘟方剂治疗，按照“文中1.6”所确定的最优给药方式和剂量给药；第2组为对照组，灌服等体积的无菌水治疗；第3组为健康对照组。连续7 d每天观察记录小鼠的发病死亡情况，计算治疗有效率。

1.8 数据处理与统计

使用Graphpad prism 9.0软件对数据进行汇总和统计分析，使用log-rank检验检测不同处理组小鼠存活曲线的差异，以P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 连花清瘟方剂对巴氏杆菌的体外抑菌效果

连花清瘟方剂对巴氏杆菌抑菌试验结果见表2。由表2可知：连花清瘟方剂对不同巴氏杆菌临床分离株的抑菌作用相近，MIC值4~8 mg/mL，MBC值8~16 mg/mL。

2.2 最优给药剂量分析

不同剂量的连花清瘟方剂治疗小鼠均未出现明显毒副反应（表3），无论每天单次给药，还是每天分3次给药，随着高剂量给药的增加，小鼠的治疗有效率提升。高剂量给药时，每天仅1次灌服给药，治疗有效率最高，为60%，且试验操作简单。故后续试验研究中，连花清瘟方剂均采用每天单次高剂量给药。

2.3 连花清瘟方剂对巴氏杆菌感染的治疗效果

不同药物对小鼠感染巴氏杆菌后的治疗效果见表4。由表4可知：连花清瘟方剂对小鼠的治疗有效率（60%）极显著高于对照组（0%）（P<0.000 1）；抗生素阿莫西林和头孢克洛对小鼠的治疗有效率分别为70%、90%，略高于连花清瘟方剂治疗组，但差异不显著（P值分别为0.773 7、0.140 5）。

2.4 连花清瘟方剂对猪丹毒丝菌感染的治疗效果

体外抑菌试验显示：连花清瘟方剂对猪丹毒丝菌SE38株的MIC值为64 mg/mL，MBC值为128 mg/mL。猪丹毒丝菌攻毒后（表5），连花清瘟方剂治疗组存活1只小鼠，治疗有效率为10%，与对照组治疗有效率（0%）无明显差异。

3 讨 论

体外试验和体内试验的试验结果均显示：连花清瘟方剂对巴氏杆菌具有良好的抗感染作用。MIC测定结果显示：与其他病原菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等^[4]）相比，巴氏杆菌对连花清瘟方剂具有较高的敏感性。阿莫西林和头孢克洛是2种常用的抗生素，连花清瘟方剂对小鼠的治疗有效率与其无显著差异，这说明连花清瘟制剂作为抗菌药替代品具有良好的应用前景。然而，本研究所用到的动物样本较少，导致所展现的连花清瘟方剂抗菌效果可能存在偏差，未来需要开展更多动物试验评估其抗菌效果。

本研究的体内体外试验均显示：连花清瘟方剂对巴氏杆菌的抗感染优于猪丹毒丝菌，这可能与巴氏杆菌是呼吸道致病菌而猪丹毒丝菌是消化道致病菌有关。有研究^[10-11]表明，连花清瘟方剂对同为呼吸道疾病的肺炎支原体感染也具有良好的治疗作用。连花清瘟具有清瘟解毒，宣肺泄热的作用，常被用于治疗流行性感冒等热毒袭肺证^[12]。因此，笔者认为连花清瘟方剂在减抗行动中也应主要应用于呼吸系统相关病原菌感染的防治。

本研究中，连花清瘟方剂仅使部分巴氏杆菌感染小鼠存活。这一现象在其他中药抗菌研究中也出现过^[13]，可能是由于不同小鼠个体对连花清瘟颗粒的生物利用度不同导致。本试验结果也表明，通过增加连花清瘟颗粒的给药剂量可以提高治疗效果。以后的研究中应注意采取增加生物利用度的方法，如改变剂型等以提高治疗效果^[14]。此外，本试验的治疗时间仅有3 d。连花清瘟方剂灌服治疗组中在巴氏杆菌攻毒5、6 d后各死亡1只小鼠，此时距离最后一次灌药已经过去3~4 d。因此，延长治疗时间也可能提高小鼠的治疗有效率。

本研究中连花清瘟方剂对猪丹毒丝菌感染的治疗剂量直接参照了对巴氏杆菌感染的治疗剂量。最优给药剂量的确定标准是在无毒副作用的前提下给药剂量尽量高，给药剂量大意味着更高的血药浓度和更高的抗菌活性^[15]。试验结果表明，每天1次高剂量给药无明显毒副作用，其他的研究也有类似发现^[16]。因此，本研究以每天1次高剂量给药作为连花清瘟方剂的最优给药方式。进一步的巴氏杆菌抗感染试验证明了这一给药方式确实具有最高的治疗有效率。因此，本研究在对猪丹毒丝菌治疗试验中也使用了该剂量。

连花清瘟方剂对巴氏杆菌具有良好的抗感染效果，其在兽医领域具有良好的应用前景，本研究也为将其应用于减抗行动奠定了基础。

参考文献

[1] 中华人民共和国农业农村部. 农业农村部关于印发《全国兽用抗菌药使用减量化行动方案（2021—2025年）》的通知[EB/OL].(2021-10-21)[2024-09-23].

[2] WANG M, FU R, XU D, et al. Traditional Chinese Medicine: a promising strategy to regulate the imbalance of bacterial flora, impaired intestinal barrier and immune function attributed to ulcerative colitis through intestinal microecology[J/OL]. J Ethnopharmacol, 2024,318(PtA): 116879[2024-09-23].

[3] SHEN X, YIN F. The mechanisms and clinical application of traditional Chinese medicine Lianhua-Qingwen capsule[J/OL]. Biomed pharmacother, 2021,142:111998[2024-09-23].

[4] 史利克,王悦,董星,连花清瘟联合美罗培南对耐药菌株的体外抑菌实验[J].中华医院感染学杂志, 2019,29(8):1172-1175.

[5] OPRIESSING T, FORDE T, SHIMOJI Y. Erysipelothrix spp.: past, present, and future directions in vaccine research[J/OL]. Front Vet Sci, 2020,7:174[2024-09-23].

[6] DOMANSKA-BLICHARZ K, OPOLSKA J, LISOWSKA A, et al. Bacterial and viral rodent-borne infections on poultry farms. An attempt at a systematic review[J]. J Vet Res, 2023,67(1):1-10.

[7] ZHU W, FAN Z, QIU R, et al. Characterization of Pasteurella multocida isolates from rabbits in China[J/OL]. Vet Microbiol, 2020,244:108649[2024-09-23].

[8] ZHU W, WU C, KANG C, et al. Evaluation of the protective efficacy of four newly identified surface proteins of Erysipelothrix rhusiopathiae [J]. Vaccine, 2018,36(52):8079-8083.

[9] 康敏,王仁生,刘文其,血清药理实验方法学在抗鼻咽癌中药筛选中的应用[J].临床医学工程, 2013,20(1):16-18.

[10] 王艺竹.连花清瘟胶囊对呼吸道感染相关细菌生物膜的抑制作用研究及其遗传机制初探[D].长春:吉林大学, 2014.

[11] JIA Z, Wu Y. Clinical applications and pharmacological research progress of Lianhua-Qingwen capsules/granules[J]. Journal of traditional Chinese medical sciences, 2021, 8(2): 101-109.

[12] 李磊.连花清瘟颗粒联合磷酸奥司他韦颗粒治疗小儿甲型流行性感冒的临床研究[J].中国医药指南, 2024,22(7):62-64.

[13] 朱战波,刘宇,卢杰,中草药菌毒灵对鹅源致病菌的抗菌作用研究[J].中兽医医药杂志, 2008(4):35-36.

[14] ZHU Y, YE J, ZHANG Q. Self-emulsifying drug delivery system improve oral bioavailability: role of excipients and physico-chemical characterization[J]. Pharm nanotechnol, 2020,8(4):290-301.

[15] 申庆荣,李刚,卢秋玉,万古霉素血药浓度的影响因素分析[J].中国抗生素杂志, 2017,42(5):429-434.

[16] 郭海,杨进,龚婕宁,连花清瘟胶囊对流感病毒感染小鼠肺组织γ-IFN的影响[J].河南中医, 2007(5):28-29.

基金资助

河北省省属高等学校基本科研业务费项目(KY2023002)

河北省自然科学基金项目(C2022204228)

河北省现代农业产业技术体系建设专项(HBCT2024230201)