在现代畜牧养殖中，抗生素滥用已引发一系列问题，如动物体内菌群失衡
[1]、抗生素残留
[2]以及耐药性的增强
[3]，寻找抗生素的有效替代品成为当前畜牧业亟待解决的关键问题。饲料中添加抗菌免疫肽是极具潜力的替抗途径
[4]。抗菌免疫肽具有广谱抗菌活性，能有效抑制多种病原菌生长繁殖，且不易产生耐药性，安全性高，可促进动物生长发育、增强机体免疫力
[5-8]。然而，从自然界提取抗菌免疫肽面临资源有限、提取工艺复杂、成本高昂等问题
[9]；化学合成虽能在一定程度上解决抗生素来源有限的问题，但合成过程复杂，副产物多，成本较高且可能存在环境污染风险
[10-11]。因此，迫切需要寻找新型的抗菌免疫肽合成技术以满足新型抗生素替代品生产以及养殖生产的需要。
生物合成技术的出现为抗菌免疫肽生产提供了新方向，其具有可精确调控、成本较低、产量较高、环保等优势
[12]。在常见的生物合成宿主中，酵母表达系统虽有一定优势，但蛋白修饰可能影响抗菌免疫肽活性，且发酵工艺复杂、成本高
[13]；乳酸菌和枯草芽孢杆菌表达量相对有限，表达产物稳定性欠佳
[14-15]。而大肠杆菌生长迅速、易于培养、遗传背景清晰、转化效率高，是理想的表达宿主
[16]。其中大肠杆菌Nissle 1917（EcN）作为益生菌，可在肠道定植，调节肠道菌群平衡，增强肠道屏障功能，安全性高，应用前景广阔。
抗菌免疫肽Scygonadin（Scy）具有独特的抗菌机制和良好的抗菌活性，虽有在酵母中表达的报道，但产物纯化繁琐、产量低，限制了其大规模应用
[17]。研究表明其在体外有抑菌作用
[17]，但体内对炎症、肠道健康的影响等研究未见报道。本研究通过基因工程技术将抗菌免疫肽基因
Scy导入EcN中，构建新型EcN-Scy，探究其对小鼠结肠炎的缓解作用，有望克服抗菌免疫肽Scy因生产成本高、纯化繁琐导致其在畜牧领域应用困难的问题，实现抗生素的有效替代，为畜牧养殖的绿色、健康发展提供有力支持。
1 材料与方法
1.1 试验菌株、质粒及基因
本试验使用的克隆宿主为DH5α感受态细胞，购自北京擎科生物科技股份有限公司（北京，中国）；表达宿主为大肠杆菌EcN、表达载体为pnirBMisl（pnir），基因Scy在GeneBank数据库中的收录号为No. AY864802，以上均为本实验室保存。
1.2 试验设计和饲养管理
试验选用20只8周龄雌性BALB/c小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号为SCXK(沪)2022-0004。本试验按照《实验动物福利伦理审查指南》（GB/T35892—2018）实施。小鼠饲养在浙江大学实验动物中心，室温维持在（22±2） ℃，湿度为（55±5）%，遵循12 h光/暗循环，可以随意进食和饮水。
1.3 试验方法
1）EcN-Scy的构建。通过PCR技术扩增载体pnir与目的基因
Scy，引物由北京擎科生物有限公司设计并合成，引物序列见
表1。
目的基因与质粒PCR扩增后，在浓度1.5%琼脂糖凝胶上进行点样与电泳。经电泳分离后，切胶并按照DNA试剂盒说明书回收DNA片段。接着将胶回收纯化后的基因Scy通过同源重组反应连接到线性化载体pnir，并转化至大肠杆菌感受态DH5α，经过热激转化后涂至氨苄抗性平板上37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆子鉴定并送至北京擎科生物有限公司测序。
将测序正确的阳性克隆子接种在LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min过夜培养；按照质粒小提试剂盒说明书提取重组载体pnir-Scy。将一定量载体加入100 µL融化的冻存感受态EcN中混匀后，转入预冷的电转池中进行脉冲电转，设置条件为2.5 kV，随后迅速加入900 µL的LB培养基，37 ℃，200 r/min培养1 h，在含有抗性的LB平板上进行筛选。
将上述筛选出的工程菌送至北京擎科生物有限公司测序，基因序列对比正确即证明EcN-Scy构建成功。
2）动物分组、建模及给药。选取20只8周龄雌性BALB/c小鼠，1周适应性喂养后，随机分为4组，每组5只，分别为对照组、DSS组、DSS+EcN组、DSS+EcN-Scy组。动物试验设计见
表2。
3）小鼠体质量与结肠长度及其形态的评估。每2 d记录小鼠体质量，第14天麻醉后处死小鼠。摘眼球采血，收集小鼠血液至1.5 mL离心管中。
采集小鼠肠道进行长度测量，测量后置于4%多聚甲醛中固定，进行H&E染色。
4）血清生化指标检测。血清中白蛋白（Alb）、乳酸脱氢酶（LDH）、总胆红素（TBil）、血清碱性磷酸酶（ALP）和尿素（Urea）采用日立7600全自动生化分析仪检测。
5）血清和肠道炎症因子水平检测。血清和结肠研磨上清液的炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10和IL-4含量使用武汉塞维尔炎症因子试剂盒进行检测，具体操作步骤按照说明书进行。
1.4 数据处理
数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析（ANOVA）处理，采用Turkey法进行多重比较，数据以“平均数±标准差”表示，结果采用Graphpad Prism 10.1软件进行制图。
2 结果与分析
2.1 基因Scy和载体pnir扩增结果
由
图1可知，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR线性化质粒的产物大小为3 949 bp，目的基因
Scy产物大小为306 bp，观察到的条带与预期位置相近，提示扩增出的条带即为线性化载体pnir与目的基因
Scy。
2.2 EcN-Scy对DSS处理导致的结肠炎小鼠体质量的影响
由
图2可知，与对照组相比，所有DSS处理组相对体质量在第6天开始下降。在第10天，所有DSS处理组相对体质量均达到最低值，其中DSS组相对体质量最低，为初始体质量的87.4%。
第10天之后，所有DSS处理组相对体质量开始上升。与DSS+EcN组相比，DSS+EcN-Scy组小鼠在第6天相对体质量下降幅度显著降低（P<0.05）。在第10~14天，DSS+EcN-Scy组相对体质量显著高于DSS组与DSS+EcN组（P<0.05），且在第14天DSS+EcN-Scy组相对体质量恢复至原始体质量的98.6%。
2.3 EcN-Scy对结肠炎小鼠的结肠长度及其形态结构的影响
由
表3可知，与对照组相比，DSS组和DSS+EcN组小鼠的结肠长度显著缩短，分别为对照组结肠长度的73.1%、76.2%。与DSS组相比，DSS+EcN-Scy组小鼠的结肠长度得到了显著恢复（
P<0.05），恢复至对照组结肠长度的94.9%。而DSS+EcN组相较DSS组结肠长度并未发生显著变化（
P>0.05）。
由
图3可知，DSS组小鼠的结肠绒毛结构遭受了明显损伤。具体表现为绒毛变短、稀疏，排列紊乱，且绒毛顶端出现了糜烂或坏死的现象。同时，绒毛与绒毛之间的隐窝结构也呈现出增生或紊乱的状态。DSS+EcN-Scy组显著改善了结肠绒毛结构的受损状况，绒毛排列更加规整，且顶端糜烂或坏死的现象得到了明显缓解，形态结构与对照组更加接近。
2.4 EcN-Scy对结肠炎小鼠血清生理生化的影响
由
表4可知，与对照组相比，DSS诱导小鼠结肠炎后，血清中的ALP、Alb和Urea水平分别显著降低65.2 U/L、5.68 g/L和2.55 mol/L（
P<0.05）；同时LDH和TBil水平分别显著升高280 U/L、0.88 μmol/L（
P<0.05）。与DSS组相比，DSS+EcN组血清ALP、Alb、Urea和LDH水平并未发生显著变化（
P>0.05），TBil水平显著升高0.28 umol/L（
P<0.05）。与DSS组相比，DSS+EcN-Scy组血清中ALP和Urea水平分别显著升高28.6 U/L和1.35 mol/L（
P<0.05），TBil和LDH水平有降低趋势（
P>0.05），趋于对照组水平。与DSS+EcN组相比，DSS+EcN-Scy组血清中TBil水平显著降低0.6 μmol/L（
P<0.05），其他指标差异不显著。
2.5 EcN-Scy对结肠炎小鼠血清炎症因子水平的影响
由
表5可知，与对照组相比，DSS组小鼠血清中IL-1β水平升高了23.7%（
P<0.05），TNF-α和MCP1水平也有上升趋势（
P>0.05）。与DSS组相比，DSS+EcN-Scy组TNF-α、MCP1和IL-1β水平分别显著降低了18.9%、50.9%和8.9%（
P<0.05），其中IL-1β水平更接近对照组。与DSS+EcN组相比，DSS+EcN-Scy组TNF-α和MCP1水平均显著降低（
P<0.05），分别降低了21.4%和71.2%。同时IL-1β水平也有降低趋势（
P>0.05）。
2.6 EcN-Scy对结肠炎小鼠结肠炎症因子水平的影响
由
表6可知，与对照组相比，DSS组小鼠结肠组织中MCP1和IL-6水平均显著升高（
P<0.05），分别升高了8.5%和30.6%；同时TNF-α水平有升高趋势（
P>0.05），而IL-10的水平有降低趋势（
P>0.05）。与DSS组相比，DSS+EcN-Scy组MCP1和IL-6水平均显著降低（
P<0.05），TNF-α水平有降低趋势（
P>0.05），分别降低了40.4%、21.9%和5.8%；IL-10的水平显著升高了60.9%（
P<0.05）。其中，TNF-α和IL-6更接近对照组水平。与DSS组相比，DSS+EcN组各指标水平差异不显著（
P>0.05）。
3 讨论
作为动物体内最重要的消化器官，肠道不仅承担着营养物质的消化和吸收功能，还参与四大屏障功能（机械屏障、化学屏障、免疫屏障和微生物屏障）
[18]，对防止外来物、致病菌或微生物的侵入，保护动物的健康和生产性能起着至关重要的作用。而结肠炎是畜牧业中常见的肠道疾病之一，会导致动物出现腹泻、粪便异常（如含有黏液、血液等）、食欲下降、体质量减轻等症状，严重时动物可能出现脱水、电解质紊乱、酸碱平衡失调等生命危险
[19]。
合成生物学作为新技术，可以对微生物群落进行精细设计与改造，深入挖掘微生物间的协作机制。畜牧业中肠道疾病频发，而肠道微生物群落对动物健康影响重大。合成生物学可以通过构建功能特异的微生物群落，这些群落能调节肠道微生态、强化屏障功能、抑制病菌、调节免疫
[19-20]，为畜牧业肠炎治疗开辟新途径，有望解决肠道疾病问题。Wen等
[6]构建了表达抗菌免疫肽KR-32的重组枯草芽孢杆菌WB800-KR32，研究发现断奶仔猪灌喂WB800-KR32可以显著减轻肠产毒素大肠杆菌（
ETEC K88）诱导的肠道炎症、抑制
ETEC K88的定植、调控肠道微生态平衡和促进肠道抗氧化能力，同时WB800-KR32可以在仔猪肠道中稳定分泌KR-32。Xie等
[22]构建了可以编码乳铁蛋白肽的罗伊氏乳杆菌CO21，将其饲喂给感染
ETEC的21日龄仔猪，发现其降低了感染
ETEC仔猪肠黏膜炎症因子的产生和氧化应激。本研究将来源于蟹精液的一种抗菌免疫肽基因
Scy导入益生菌EcN中，构建了EcN-Scy。在小鼠结肠炎模型中，EcN-Scy工程菌展现出了抗炎作用。与DSS诱导的结肠炎小鼠相比，接受EcN-Scy治疗的小鼠在体质量下降幅度、结肠长度恢复以及结肠绒毛结构改善等方面均表现出明显优势。这些结果表明EcN-Scy对DSS损伤具有缓解作用，其保护效果可能与维持肠道结构完整性密切相关。此外，EcN-Scy工程菌还能显著调节血清和结肠组织中的炎症因子水平，降低TNF-α、MCP1和IL-6等促炎因子的表达，同时增加IL-10等抗炎因子的表达，这些调节有利于纠正机体免疫失衡，从而改善肠道免疫屏障。
4 结论
利用基因工程技术构建的EcN-Scy，在小鼠结肠炎模型试验中展现出了治疗效果。该工程菌能够有效改善DSS诱导的小鼠体质量下降，改善结肠的长度和形态结构，调节血清中的生理及生化指标，并显著降低血清和结肠中的炎症因子水平。
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